细胞色素P4502C9药物代谢酶体外酶学活性检测新方法的建立.pdfVIP

医学研究杂志 2013年2月 第42卷 第2期 ·论 著 · 细胞色素 P4502C9药物代谢酶体 外酶学活性检测新方法的建立 王双虎 戴大鹏 胡利明 耿培武 蔡剑平 胡国新 摘 要 目的 建立一种基于 COS一7细胞的细胞色素 P4502C9(CYP2C9)体外酶学活性检测的新方法。方法 以野生型 CYP2C9 1基 因的全长 eDNA为模板 ，通过定点诱变方法获得突变型 CYP2C9 2、3及 13的cDNA全长 ，分别与分泌型荧光素 酶 Gluc内参基 因一起导入 pIRES载体的A、B多克隆位点，构建成双表达载体 plRES—Gluc—CYP2C9。利用 Lipofectamine2000 瞬时转染 COS一7细胞 ，48h后弃培养基 ，加入含 lO01~mol／LLuciferin—H荧光底物的新鲜培养基 ，继续培养 8h后利用 Promega CYP2C9活性试剂盒及 NEBGluc检测试剂盒分别检测 CYP2C9各型及 内参 Gluc的活性 ，用 Westernblot检测两种蛋 白的表达量 。 结果 本研究成功构建 了pIRES—Gluc—CYP2C9 1及其突变体 2、3、13的表达载体 ，通过检测 CYP2C9特异性荧光素底物 Luci~rin—H的分解产物 的荧光信号与分泌型荧光素酶 Gluc的内参荧光信号的比值作为 CYP2C9的体外酶学活性值 ，研究结果 显示突变体 CYP2C9 2、3、13的体外酶学活性分别为野生型 CYP2C9 1的43．12％、8．15％和 1．49％。结论 本研究成功建 立 了一种基于 COS一7细胞 的CYP2C9体外酶学活性检测的新方法 ，该方法操作简便、实验周期短 ，适于新突变体 CYP2C9的快 速活性检测及其代谢新药物或抑制剂 的相关性研究。 关键词 CYP2C9 Westernblot 体外活性分析 ANovelinvitroFunctionalAnalysisMethodforCYP2C9Protein． WangShuanghu，DaiDapeng，HuLiming，GengPeiwu，CaiJian- ping，HuGuoxin．DepartmentofPharmacology，WenzhouMedicalCollege，Zhejiang325035，China Abstract Ohaective ToconstructanovelinvitroCYP2C9functionalanalysismethodusingCOS—-7cellSOastosimplifytheanal·· ysisprocessand improvethereliability．M ethods Full—length cDNA fragmentsofvariantsCYP2C9 2． 3 and 13wereobtainedby PCR site—directedmutagenesisusing thecDNA ofwild typeCYP2C9 1astheDNA template．Theproductsandopenreadingframe (ORF)ofinternalcontrolGlucwereinsertedintothemultiplecloningsitesAandBofdual—expressionvectorpIRESseparately．Resul— tingplasmidwasnamedpIRES—Gluc—CYP2C9andtransfectedintoCOS一7cellusing lipofectamine2000reagent．Forty—eighthours later．theculturemediumwasdiscardedandreplacedwithfleshmedium containingLuciferin—H (1O0~mol／L)andthecellswereincu— batedat37℃ foradditiona18hoursinCO incubator．ThenthecatalyticactivitiesofCYP2C9 variantsandinterna1controlproteinGluc weredetected separatelyusingthecorrespondingP