组鸡γ干扰素在昆虫细胞中的高效表达.pdfVIP

中国畜牧兽医学会禽病学分会禽流感及免疫抑制病论坛论文集 组鸡Y一干扰素在昆虫细胞中的高效表达 孔桂美许金俊秦爱建金文杰刘岳龙 (扬州大学江苏省动物预防医学重点实验室，江苏扬州225009) 株的抗病毒活性试验，发现rChIFN—Y对AIV—H5和MDVGA株病毒有明显的抑制其致细胞病变作用，但对 NDV F48E8株病毒在体外不能抑制其致细胞病变作用，仅能在病毒滴度上表现抑制效果。 关键词：重组鸡Y一干扰素；杆状病毒；表达；抗病毒作用 [I] 菌、COS细胞、杆状病毒、鸡痘病毒、禽腺病毒以及植物烟草花叶病毒表达ChIFN—Y，对其生物学活性进 『2—61 『7] 行了大量研究 。本实验室也成功克隆出了ChIFN—y基因，并在大肠杆菌和COS细胞上进行了表达和初 定的接种剂量下活性最高，从而为开发和应用rChIFN—Y奠定了坚实的基础。 1材料与方法 1．1材料 、～ f71 TM 1 和DHIOBac购自GIBCO公司；大肠杆菌DH5Q由本室保存。 frugiperda9，Sf9)、水泡性口炎病毒(VSV)、 1．1．2细胞和病毒：草地贪夜蛾卵巢细胞系(Spodoptera 1．1．3试剂：脂质体转染试剂(LIPOFECTIN 酶屁0RI、Not 自Sigma公司；T4 『7] 高免血清按照文献方法制备。 L2杆状病毒重组鸡Y一干扰素转移载体pFASTBACl一ChIFN—Y的构建 用艮0RI和Not 211 中国畜牧兽医学会禽病学分会禽流感及免疫抑制病论坛论文集 产物40C连接过夜，转化DH5 Q感受态细菌，筛选出的重组质粒命名为pFASTBAC卜ChIFN—v。 四次筛选纯化，阳性质粒命名为Bacmid—ChIFN—y，提取阳性质粒DNA用于下一步转染。 i．4Sf9细胞的转染及间接免疫荧光(IFA)检测 将重组质粒Bacmid—ChlFN—Y用脂质体转染试剂按GIBCOBRL公司说明书中的转染程序转染Sf9细胞， PBS洗3次。荧光显微镜下观察记录，同时设野生型病毒基因组转染Sf9细胞、Sf9正常细胞作为阴性对照。 1．5重组杆状病毒的扩增和表达条件的优化 将病毒分别以不同的MOI(每个细胞的病毒感染量)感染Sf9细胞并于感染后不同时间收集表达产物上 法进行计算，最终确定重组病毒的最佳感染量和最佳蛋白表达时间。以每mL干扰素样品的最高稀释度仍能 保护半数细胞(50％)免受病毒攻击的稀释度的倒数值定义为1个干扰素单位(U)。 1．6重组ChIFN—Y抗病毒活性测定 按照步骤1．2．4测定的结果将表达产物进行系列稀释，每孔加100BL，将单层鸡胚成纤维细胞分别致敏 4 F48E8病毒，10TCID50禽流感病毒(H5N1)， 24h和48h后，然后再分别接种1、10和100×TCID。．的NDV Ju GA株，待病 24h后观察半数细胞保护情况；用同样方法致敏单层鸡胚成纤维细胞后接种不同空斑数的MDV 毒吸