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草菇冷诱导相关基因及其上游序列结构分析 孙晓红1,2冯爱萍2 汪虹2 陈明杰2． 潘迎捷3 2上海市农业遗传育种重点实验室上海市农业科 (·南京农业大学资源与环境科学学院南京210095 3上海水产大学 上海200090) 学院食用菌研究所上海201106 摘要：在利用利用差异显示技术分离获得草菇低温特异DNA片段基础上。通过采用PCR标记技术对获得的 低温特异性片段进行DIG标记，以此为探针．对草菇eDNA文库进行筛选，获得阳性克隆．对阳性克隆进行 DNA测序及序列的比较分析发现，其中的一个序列与B-腺苷一L-高半胱氨酸水解酶有很高的同源性，这可能 与草菇的耐寒机制有关。通过比较该基因的eDNA和DNA序列。发现该基因存在6个内含子，采用5RACE 对该基因的上游片断进行扩增分析。获得该基因的全都序列及上游部分序列，该序列基因库登陆号为 AY208946。 关键词：草菇低温诱导基因上游调控序列 volvace8 草菇[VolvarieHa03u11．：Ft．)Sing．】又名稻草菇、中国蘑菇。草菇味道鲜美，富含蛋白质和必需 氨基酸，对增强人类体质，提高免疫力，以至防癌、抗癌都有良好的作用，是一种健康食品(张树庭，1975)。 然而由于草菇是一种高温型的食用菌。不耐低温冷藏，在常规低温冷藏条件下(4℃)，其菌丝会发生自溶死 亡(张树庭，1975，Chang，1978)。这一特性严重限制了草菇的生产、新鲜草菇的流通、低温冷藏保鲜和出口 创汇以及革菇菌种的低温保藏。 植物在低温条件下经历一段时间后。其体内会发生一系列显著的变化，发生这些变化的根本原因及作 用目前还难以阐释清楚(马建忠。1995)。随着分子生物学和生物技术的迅速发展，植物的抗寒机理，抗寒冻 1995)。本研究采利用本实验室mRNA差异显示技术分离得到的低温特异DNA片段为探针。通过建立草菇 V23的eDNA文库进行筛选获得与冷诱导相关的基因序列，并在此基础上，采用5’RAClg技术获得该基因 的上游调控序列。 1材料与方法 1．1材料 1．1．1供试菌株：草菇fVolvariella volvaeea)V23从南汇县草菇中经组织分离获得，由上海市农业科学院 食用菌研究所菌种保藏中心保藏。 1．1．2培养基：LB培养基用于大肠杆菌的培养，PDY培养基(马铃薯20％，葡萄糖20％，酵母提取物0．1％) 用于V23菌丝的培养。 Rnase-Free 1．1．3工具酶及试剂：Taq酶、蛳I酶、RQl DNA anddetection Mannheim公司． dU’IP和地高辛标记检测试剂盒(Diglabelling Kit)购白于Boehringer Trizol试剂、PCR产物纯化试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司。5’RACE试剂盒购自Invitrogen公司。 1．2方法 1．2．1草菇V23cDNA文库的构建：由联合基因公司完成V23cDNA文库的构建的工作。 1．2．2草菇低温特异基因分离鉴定按照文献(陈明杰等1998)进行。 1．2．3筛库探针的制备：选择4个低温特异性DNA片段按文献方法(进行地高辛标记进行以下的实验。 1．2．4 eDNA文库阳性克隆的筛选：菌落平板的制备和将菌落转移到尼龙膜的操作参考分子克隆(J．萨姆布 鲁克。1992)。核酸的预杂交和杂交均在68℃下进行，杂交后的洗膜和显色按地高辛标记检测试剂盒说明书 进行。 1．2．5DNA操作：大肠杆菌的培养、质粒DNA提取、限制性内切酶酶切反应、琼脂糖电泳等操作参考分子 克隆(J．萨姆布鲁克。1992) 1．2．6 eDNA序列测定及DNA序列测定：阳性克隆菌株质粒由联合基因公司进行克隆片段的cDNA序列 测定 ·为本文的通讯作者 本项目由上海市科学技术发展基金资助。项目编号．-003912076 12fi 菌物学报 24卷 1．2．7 5·Race按照试剂盒得操作步骤进行。 2结果与讨论 草菇低温诱导特异片断的分离、鉴定详见(陈明杰。2000)。以草菇低温特异基因