蚓激酶基因乳腺表达载体构建及牛乳腺瞬时表达.pdfVIP

2,28毋主圉垫塑塑篮宣砷硒窒堂星 蚓激酶基因乳腺表达载体构建及牛乳腺瞬时表达① 刘殿峰1② 张嘉保1 王正臣2姜宁3 (1．吉林大学实验动物中心，长春，130062) (2．长春市家畜繁改技术服务销售中心，长春，130062) (3．吉林市丰满区畜牧兽医总站，吉林，132013) 且两种质粒的同剂量溶圈直径之间差异也不显著。以上结果表明，改造后的蚓激酶基因可以在泌乳期 黑白花奶牛乳腺中实现瞬时表达，以500p．g的注射剂量表达效果最佳。 关键词：蚓激酶；瞬时表达；乳腺；稀有密码子 蚓激酶(Lumbmkinase，LK)是存在于我国传统巾药地龙(即蚯蚓，lumbficus 组分丝氨酸蛋白酶，在人体内可直接或经纤溶酶途径溶解纤维蛋白，具有改善血液流变状态、溶解血 栓、再通血管的功能。日前已有数种蚓激酶制剂进入临床应用，疗效切实可靠。以上蚓激酶制剂均 为口服剂型，为蚯蚓粉或其提取物，存在大量的未知组分，对人体机能的远期影响尚不明确。获得组 分明确的中药制剂是中药现代化发展的重要方向，也是蚓激酶研究领域中亟待解决的问题之一。近 年来，中、日、韩等国学者开展了蚓激酶基因克隆方面的研究，但尚未见成功表达的报道。在蚓激酶 cDNA原序列中，有14个氨基酸由真核表达稀有密码子所编码，表达效率是否与这些稀有密码子有 关尚需进一步研究。 本试验参照现有的蚓激酶基因序列，按照有利于真核表达的原则，对蚓激酶F．III．1基因的稀有密 码子进行了改造并进行了cDNA序列人T合成，以山羊口一酪蛋白启动子(口一caseill 分，构建了乳腺组织特异性表达载体和重组逆转录病毒载体，在黑白花奶牛乳腺实现了蚓激酶的瞬时表 达。为进一步研究蚓激酶的其他特性，获得稳定表达蚓激酶的转基因牛奶奠定了基础。 l材料与方法 1．1质粒、菌株及细胞株 JMl09由本室保存。 转录病毒表达中间载体pLNC—LacZ由本室构建并保存；E．coil 1 2主要试剂 限制性内切酶、T4DNA连接酶、DNA聚合酶I ①资助项目：“863”牛物反应器重大专项资助(2002AA撕53) ②作者简介：刘殿峰(1963．)男，在读博士，副教授，丰要从事实验动物的遗传育种、繁殖与转基因动物方而的研究]=作。 反刍动物分子遗传与育种四229 均为进口或国产分析纯级。 1．3试验动物 选用2、3胎泌乳稳定的黑白花奶牛8头为受试动物，由长春华春肉牛集团奶牛场饲养管理。 1．4蚓激酶基因的稀有密码子改造和eDNA的人工合成 密码子按有利于真核表达的原则进行修改，并在起始密码子ATG上游加人Ban证tI酶切值点，存终止密 码子TAA下游加入NotI酶切位点，以方便克隆操作。改造后序列由上海博亚生物技术有限公司合成， 并克隆人TaKaRa pMmS-r载体。 1 5袁达载体的构建及制备 L丑eZ为原始质粒，构建蚓激酶乳腺组织特异性表达载体及晕组逆转录病毒表达载体。DNA的酶切、粘 性末端补平、5’端去磷酸化、连接、转化与质粒DNA的小量与大量制备参照相关文献。 1．6 DNA转染奶牛乳腺组织 选取产犊后3个月的经产(2—3胎)泌乳期黑白花奶牛8头为受试动物，取所制备的两种质粒分别 奶样10次，每次采奶样lrol留检。 I．7牛奶中蚓激酶活性的测定 采用改进的纤维蛋白平板溶圈法(Fibrinaga—e plate 后各时段奶样的纤溶活性。标准品为尿激酶。 2结果与分析 2l蚓激酶cDNA序列的改造 参照现有的蚓激酶基因序列，按照有利于真核表达的原则，对蚓激酶F-111．1基因的稀有密码子进 行了改造并进行了eDNA序列人工合成，密码子修改情况见表1。序列测定结果表明，所合成的基因序 列与设计完全一致(AccessionNo．AY327442)。 ‘ 表1蚓激酶氨基酸密码子修改情况一览 2．2乳腺组织特异性表达载体及重组逆转录病毒表达载体的构建 本试验使用的上游调控元件为山羊口一酪蛋白启动子(bCP，Accession 图