分子信标的原理和应用.PDFVIP

分子信标的原理和应用 何旺 （北大医院泌尿外科研究所 100034） 学号 联系电话 摘要： 分子信标是一种设计巧妙的新型荧光标记核酸探针。特殊的发夹结构使分子信标具 有很强的特异性识别靶标序列的能力, 目前已成为分子生物学和生物技术中一种强有力的 研究工具。本文介绍了分子信标的原理及其在PCR实时检测、基因变异的分析、病原的检测、 分子信标传感器、活细胞内RNA检测和PNA分子信标、分子信标适体等方面的应用和研究进展。 关键词：分子信标、聚合酶链反应、肽核酸、适体 分子信标是可以特异识别核酸序列的发夹型荧光探针。由于分子信标检测的高特异性、高 敏感性、操作简便、可应用于定量分析等优点，在短短的十年里，分子信标技术从诞生到今 天已经广泛的应用于分子生物学、病原学、临床医学、化学等领域。近年来，人们又对分子 信标的结构进行了很多改造，发展出许多有更多特性的新型分子信标，使分子信标的应用更 加广泛，不再限于对核酸分子的杂交检测。已经发展出应用于蛋白质的检测的分子信标、有 催化功能的分子信标、PNA－DNA 分子信标、分子信标传感器等。 1. 设计分子信标的动机 每一种技术的出现都是为了解决一个现实中存在的问题。由于检测核酸杂交的传统方 法需要把没有发生杂交的探针去除，妨碍了核酸合成的实时检测和在活体内对核酸进行 定位，并且由于需要把目标序列或者探针固定在固体表面而增加了非特异结合的可能性， 也限制了核酸杂交检测传统方法的特异性。为了解决这些问题，1996 年，Tyagi和Kramer 首次设计了分子信标并首次描述了分子信标的结构、构象、特异性、在PCR实时监测中的 应用[1]。 2. 分子信标的结构和原理 如图 1 所示，分子信标是一个具有茎－环 （loop-stem）结构的寡核苷酸探针，通常有 25～35 个核苷酸，两端分别标上一个荧光基团和淬灭基团。 环的部分用于与靶序列杂交，通常由 15～30 个核苷 酸组成，要求与靶序列杂交后能形成与探针－靶序 列双螺旋有关的反式构型，并使干的部分打开，尽 量的使荧光基团和淬灭基团分开足够的距离。干的 部分一般由 5～8 个碱基对。荧光基团一般连在 5’ 端，淬灭基团一般连在 3’端，通常用 4-（4-二甲基 氨基偶氮苯基）苯甲酸（DABCYL）作为淬灭基团。 自由状态时，分子信标呈发夹型结构，荧光基团和 淬灭基团靠得很近，二者之间发生能量转移（FRET 和直接能量转移），荧光基团的能量被淬灭基团吸收并以热的形式散发，荧光几乎完全被猝 灭。如图 2所示，当有靶序列存在的时候，靶序列和分子信标的探针序列杂交形成有一定刚 性的双螺旋结构，导致分子信标的构象改变，干的部分打开，荧光基团与猝灭基团分开，二 者之间的能量转移终止，在有相应的单色光激活时，荧光基团发出荧光。荧光强度与溶液中 靶序列的多少成正比，通过检测荧光的强度就可以计算出靶序列的量 [1] 。 3. 分子信标的特异性 分子信标的特异性决定于茎－环结构。灵敏度和特异性可以根据不同应用的目的通过调 整GC含量来达到优化。与分子信标探针序列不是完美配对的靶序列对分子信标的荧光不会发 生任何的影响。靶序列即使只有一个碱基的改变、缺失、插入，分子信标都能检测出来。因 此分子信标对核酸分子的分辨率达到一个碱基（Single base pair accuracy） [1] 。 4. 分子信标的应用 近年来，随着分子信标技术的发展和成熟，人们不断开拓其应用领域，目前，分子信标不 仅可以用于基因的定量、定性检测，还可以用于基因点突变等的分析，将分子信标与 PNA-DNA-环技术结合，使检测双链DNA成为可能。另外，分子信标技术还为研究DNA-蛋 白质之间的相互作用提供了一种简单、直接、灵敏、实时、甚至可以用于活体检测的方法。 利用分子信标技术在分析、检测核酸和蛋白质中的优点，分子信标技术还可以作为生物芯片 和生物传感器的探针。总之，分子信标技术已经广泛的应用在基础医学研究中的众多领域。 4.1 PCR 实时监测 设计分子信标的探针序列与扩增靶序列互补，由于荧光强度与溶液中的模板的量成正比，， 通过荧光检测仪检测荧光强度的变化就可以得知PCR反应体系中扩增序列的量。利用分子信 标进行PCR合成的实时检测可以实现闭管操作，可以消除交叉污染，具有实时、高灵敏、高 特异的优点。Whitcombe等设计出一种蝎状探针, 即在分子信标的3′端同时又联用PCR 引 物,。该技术在引物与分子信标探针之间连接一个间隔臂, PCR 扩增时不会延伸至探针分子, 当有特异扩增产物出现时分子信标即与扩增产物进行分子内杂交, 茎2环结构被破坏, 产生 荧光信号。这种蝎状引物技术利用了探针