分子信标的研究及应用.PDFVIP

分子信标的研究及应用 马晓雯 李艳丽 鲁涛 蒋昱萌 【关键词】： 分子信标 分子信标原理 生物传感器 分子信标应用：实时荧光 PCR 【摘要】： 分子信标是一种基于荧光共振能量转移原理设计的一种新型核酸荧光探针，其与靶序 列结合会发生结构的变化从而影响荧光信号。因其检测具有高灵敏、高特异性，并且可用于 活体的实时检测，因而被广泛的应用于生化分析，生物医学等很多领域。本文主要就分子信 标的工作原理和应用进行介绍。 1、引言 分子信标是一种可以特异识别核酸序列的新型荧光探针，这种荧光探针是通过与核酸靶 分子进行杂交后构象发生变化而发出荧光的。这项技术是Sanjay Tyagi于 1996 年首次发明的 [1]，因其具有背景信号低、灵敏度高、特异性识别性强、操作简单以及不必与未反应的探针 分离即可实时检测等优点 ,在短短的几年内得到了迅速的发展,并已广泛地应用于实时监测 聚合酶链反应、基因突变的快速分析、ＤＮＡ、ＲＮＡ的检测、ＤＮＡ/ＲＮＡ杂交的动力 学研究以及ＤＮＡ/蛋白质相互作用研究等,其应用领域仍在不断拓展。 2、原理 2．1 分子信标的结构 分子信标属于单链寡核苷酸探针,其巧妙之处在于独特的茎环状结构(也称发夹型)。分子 信标的设计一般包括三个部分: (1)环状区：一般为长度为 15～30 个碱基的序列,其通过与待测核酸链互补结合,从而与 目标分子特异结合; (2)茎干区：通常为长度为 5～8 个碱基的互补序列,茎干区与杂交后环状区-目标分子的 双链结构之间的热力学平衡关系,使分子信标的杂交特异性明显高于常规的线状探针; (3)荧光基团和猝灭基团：荧光基团一般联接在信标分子的 5’-端;猝灭基团联接在 3’- 端。常用 4-(4’ -二甲基氨基偶氮苯基 )苯甲酸 (DABCYL)作为猝灭基团 ,德克萨斯红 (TexasRed)、荧光素(Fluoresein)等作为荧光基团。（图 1 为经典分子信标结构） [10] 2．2 工作原理 当靶序列不存在时,分子信标茎干区特异结合形成发夹结构,茎部的荧光分子与淬灭分子 非常接近(7～10ｎｍ), 当受到激发光激发时, 荧光基团发出荧光;由于淬灭分子吸收光谱与 荧光基团的荧光发射光谱重叠,因此可发生荧光共振能量转移（FRET）[2],即荧光分子发出的 荧光被淬灭分子吸收并以热的形式散发,此时荧光背景极低检测不到荧光信号;当有靶序列存 在时,分子信标的环序列与互补靶序列特异性结合, 形成相对刚性并且更加稳定的异源双链 杂交体，此时荧光分子与淬灭分子分开,二者之间的空间距离增大, 根据Foerster理论, 中心荧 光能量转移效率与两者距离的6次方成反比，所以荧光分子发出的荧光不能被淬灭分子吸收, 荧光几乎 100%恢复，从而可检测到荧光。且所检测到的荧光强度与溶液中靶标的量成正比。 [13] 2．3 分子信标的标记 通常分子信标都只修饰一个单一的发光基团，所以在一个均相体系中,通过杂交后荧光 信号的变化,一种分子信标只可检测一种靶序列。为了在一个均相体系中同时检测多种靶序 列,可以将不同的分子信标修饰以不同的荧光基团。例如,Tyagi 等利用四种不同的分子信标进 行等位基因检测。这四个信标分子环状区同一位置只有一个碱基组成不同,所连接的荧光基 团则分别具有不同的激发波长和发射波长。将这四种分子信标等量混合放入四个试管中,并 分别加入靶序列。只有与靶序列完全匹配的分子信标才能发生特异性结合,并在相应激发波 长下发射出荧光。但应用这种方法,不同的荧光基团需要不同波长的激发光激发，且发射的 荧光也不同，所以需要根据具体的荧光基团采用不同波长的激发光源和在不同的特定波长处 采集相应的荧光信号，相对测定比较困难。 为了采用单一激发光源,Tyagi等在发明了传统的分子信标后,又设计了一种荧光波长转 移型分子信标(图 3),这种分子信标的一末端连接两个不同的荧光基团 :荧光收集基团 (harvesting fluorophore)和荧光发射基团(emitting fluorophore),分子信标的另一末端连接猝灭 基团。未结合靶分子时,它与传统的分子信标一样,荧光收集基团吸收的能量传给猝灭基团, 然后能量以热的形式放出,不产生荧光;当与靶分子结合发生构象变化后,荧光收集基团的荧 光并未恢复,而是把能量以荧光共振能量转移的形式转移给荧光发射基团,荧光发射基团将能 量以荧光的形式放出，在单一光源激发下,荧光发射基团可在可见光谱区发出不同波长的荧 光。这样可以通过选择不同波长的荧光发射基团,从而使分子信标按设计的要求发出不同颜 色