重组MPT83蛋白检测牛结核病间接ELISA方法的建立.pdfVIP

牛羊马传染病 在最佳反应条件下，得出的标准曲线相关关系R2值达到了0．9994，说明该标准品可以 满足实验要求，做为实验的标准品是合格的；整个扩增过程在30分钟内就可以完成，其敏 感性达到了10个拷贝，与巢式PCR的敏感性相当，大大高于常规的细菌学和血清学检测方 法；该方法同时表现出优良的特异性和稳定的重复性。2003年以来的禽流感疫情，使PCR 检测技术迅速成为或正在成为各级动物防疫监督检测机构的主要检测技术平台之一，为本方 法的临床应用提供了必要的硬件保证和技术储备，使本方法的推广和应用更加容易实现。用 本方法对临床样本的检测中，PPD试验阳性，巢式PCR检测也为阳性的30份临床样本进行 荧光定量PCR检测的结果全部为阳性，说明在对临床样本进行检测时，如果两种方法的结 果是一致的，结果的可靠性是很高的；而对PPD检测阳性，巢式PCR检测为阴性的15份 临床样本进行检测时，2份为阳性，其余为阴性，可能原因是定量PCR的敏感性在有些情 况下可能比巢式PCR略高，另一方面有假阳性的可能性但可能性较小；在对2份PPD检测 阴性而巢式PCR检测阳性的临床样本的检测结果也为阳性，进一步证实了巢式PCR结果的 可靠性。通过分析可知，法定方法PPD试验、巢式PCR方法和荧光定量PCR方法结果的 ～致性很高，三种方法相结合，可使临床检测结果更加准确可靠，对牛结核病的检疫、控制 乃至根除具有十分重大的经济效益和社会效益16J。 参考文献略 重组MPT83蛋白检测牛结核病间接ELISA方法的建立 鲁俊鹏1，罗满林p，林琳2，邹潍力1 (1．华南农业大学兽医学院，广东广州，510642；2．广东省动物防疫监督总所，广东广州，510230) 摘要：用纯化的牛分支杆菌重组MPT83蛋白作为包被抗原，建立了检测牛分支杆菌抗体的间接ELISA 方法．确定了间接ELISA各组分的最适反应条件为：抗原包被浓度为1 600倍， lag／mL，二抗稀释倍数为1 min，阴 血清稀释倍数为60倍，抗原和血清、血清和二抗都是在37℃下反应30min，底物在37℃显色15 阳性临界值定为：D655nm=0．5．通过阻断试验，交叉试验、重复性试验表明该方法特异性强、重复性好． 最后用建立的间接ELISA方法对145份结核茵素试验阳性牛的血清和36份结核菌素试验阴性牛的血清进 行了检测，结果表明阳性血清的符合率为17．9％，阴性血清的符合率为91．7％． 关键词：牛分支杆菌；重组MPT83蛋白：间接ELISA 牛结核病(Bovine bovine)引起的一种 tuberculosis)是由牛分支杆菌(Mycobacterium 人畜共患的慢性传染病，发病普遍，近年来，随着耐药性菌株的产生及个体养牛户的增加， 结核病的阳性检出率在逐年上升，严重影响了养牛业的发展，造成了极大的经济损失。人可 通过接触患结核病牛和饮用被结核菌污染的牛奶而感染发病，危害了人类健康。尤其是2003 年广州市某大型奶牛公司属下企业．太和镇云燕畜牧发展公司卖结核牛奶事件引起了人们的 广泛关注。因此，对牛结核病的诊断与监测是一项十分重要的工作。 临床上应用最广泛的检测牛结核病的方法是迟发性变态反应试验，即结核菌素试验，对 牛皮内注射PPD(提纯的结核菌素蛋白衍生物，其中包括蛋白、脂肪类和糖类以及核苷酸等多 种抗原成分)，并在3’天后测量注射部位肿胀程度。美国就是采用扑杀结核变态反应阳性牛 的方法而消灭了牛结核病。它的技术要求不高、操作相对简单，但是周期较长、工作量大、 受操作的影响比较大。有研究者发现，该方法还存在着极强的非特异性，即在很多结核变态 反应阳性牛中，既找不出特征病变，又不能分离出结核菌，或仅仅分离出非典型的分支杆菌 [1】，重复检疫时阳性率下降，而且妊娠母牛检出率低，所以用这种方法需付出极大代价才 能控制以至消灭牛结核，因此在实践中单纯用该方法诊断牛结核病效果不是很好。 目前已建立了一系列检测牛结核病抗体的方法，其中间接ELISA是诊断牛结核病最重 要的血清学