重要海水养殖鱼类精子和胚胎冷冻保存及种质冷冻库的建立.pdfVIP

覆建爰n 第三届誊洋生物高技术论坛 2005．08．19-23 重要海水养殖鱼类精子和胚胎冷冻保存及种质冷冻库的建立女 陈松林+，田永胜，沙珍霞，季相山，于过才，赵燕，王春花，刘本伟 (中国水产科学研究院黄海水产研究所，农业部海洋渔业资源 可持续利用重点开放实验室，青岛266071) 摘要：2001—2005年开展了重要海水养殖鱼类大菱鲆、鲈鱼、牙鲆、石鲽和大西洋牙鲆的精子 和胚胎冷冻保存技术、种质冷冻库建立及冷冻精子在杂交育种中应用技术的研究，研制了以上 鱼类精子冷冻稀释液MPRS和TS2，建立了简单实用的三步降温冷冻模式，建立了重要海水 养殖鱼类精子冷冻库，冷冻保存各种鱼类精予1000ml，并且利用冷冻保存的石鲽和大西洋牙 鲆精予与中国牙鲆杂交，培育出杂交鱼石鲆鱼和中夏牙鲆，生长良好。筛选出了适宜于玻璃化 冷冻保存的胚胎时期，在以上鱼类中肌节期．心跳期胚胎较适合于冷冻保存；筛选了胚胎玻璃 化冷冻平衡方法．五步法；在牙鲆、鲈鱼和大菱鲆胚胎的玻璃化和程序化冷冻保存中共获得了 复活胚胎57粒，孵化出正常鱼苗39尾，在海水鱼类胚胎超低温冷冻保存中取得了突破性进展。 关键词：海水鱼类，精子，胚胎，冷冻保存，种质冷冻库 一 鱼类种质资源是渔业生产、优良品种培育及水产养殖业可持续发展的重要物质基础。由于 过度捕捞、环境污染、生态破坏及无序利用等导致鱼类天然资源减少，部分珍贵鱼类品种濒临 灭绝及某些鱼类种质严重退化，如果不及时采取保护措施，若干年后，在自然界中将难以找到 许多鱼类原良种的遗传资源。因此，利用低温生物学技术建立重要养殖鱼类的种质(精子和胚 胎)冷冻保存技术和种质冷冻库，将重要鱼类的种质资源以活的形式长期保存起来，成为世界 各国急待解决的重大课题。 J，随后扩 在精子冷冻保存上，国际上从80年代初开始了鲑鳟鱼类精予低温保存的研究Il 展到其他鱼类，但国际上在鱼类精子冷冻保存实用化技术和品种改良应用方面未有研究报道。 在胚胎冷冻保存上进展也相当缓慢，仅在．40。C获得4．6％(银大马哈鱼)口J一94％(斑马鱼)pJ的复 活率，也在鲤科鱼类上偶尔获得过1次冷冻成活的胚胎，但结果不能重复14J；经过近20年的 研究，国际上仍未见有关鱼类胚胎超低温冷冻保存的成功报道。本课题组自2001年开始对重 要海水养殖鱼类大菱鲆、牙鲆、鲈鱼、石鲽和大西洋牙鲆等鱼类的精予和胚胎进行了冷冻保存 研究，建立了以上主要鱼类为代表的精子冷冻库和胚胎超低温冷冻保存技术。 1材料和方法 1．1精子冷冻保存稀释液的配制： 在分析测定不同鱼类精液成分的基础上，结合海水鱼类精子不同的渗透压调节机制，利用 葡萄糖、蔗糖、还原性谷胱甘肽、小牛血清、柠檬酸、Tris碱等化学试剂，配制数十种不同的 稀释液，进行冷冻保存实验，从中筛选出分别适合于不同鱼类的精子稀释液配方l毛6，7|。 1．2精子冷冻方法的筛选 通过比较不同容积的麦管、安瓿瓶、塑料管等冻存容器对精子冷冻保存效果的影响，不 }国家“f-五”863计划海洋生物技术主题项目资助(2001AA621100和2003AA603510)。 料通讯作者，chensl@ysfri．ac．cn 414 覆建羹n。 第三届海洋生物高技术论坛 200s．08．19．23 同降温速率、不同平衡温度和平衡步骤对冻精活率影响的基础上，筛选建立鱼类精子降温冷冻 模式【5，6，7，引。 1．3精子冷冻库的建立与利用 在不同鱼类繁殖季节，用挤压法收集大菱鲆、牙鲆、鲈鱼和大西洋牙鲆等海水鱼类精子， 利用显微镜检测和评估精子的活力，选择精子活率在8O％以上的精液用于保存。 利用三步法精子冷冻保存技术f5】和大容量、自动报警液氮罐建立了重要海水养殖鱼类的精 子冷冻库。 利用冷冻保存的优良大菱鲆精液应用到大菱鲆的鱼苗培育，利用石鲽19J和大西洋牙鲆精子 与中国牙鲆杂交培育养殖新品种【l州。 1．4适宜玻璃化处理的胚胎发育时期筛选： 胚、心跳胚、出膜前期胚)在常温下利用五步法在玻璃化液中逐步平衡，不经冷冻，直接利用 适宜浓度的蔗糖液洗脱lOmin，逐次加入适合温度的水培养一定时间，统计其成活率，确定胚 胎在玻璃化液中合理