27生物化学实验--重组质粒的提取与PCR鉴定.doc

重组质粒的提取与 PCR 鉴定 【目的】 1 ．掌握碱裂解法提取质粒的方法和 PCR 的基本原理与实验技术。 2 ．熟悉 PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定法。 【原理】 ? 质粒 DNA 的提取与鉴定原理 从大肠杆菌细胞中分离质粒 DNA 的方法众多，其分离的依据可根据分子大小不同、碱基组成的差异以及质粒 DNA 的超螺旋共价闭合环状结构的特点进行。目前常用的有碱裂解法（又称碱变性抽提法）、羟基磷灰石柱层析法、质粒 DNA 释放法、酸酚法、两相法以及溴化乙锭一氯化铯密度梯度离心法。以上方法各有利弊。但总结多数实验室的实践经验，认为碱裂解法效果良好、经济且收获率较高，是一种使用最广泛的制备质粒 DNA 的方法，也是当今分子生物学研究中的常规方法。制备的质粒 DNA 可用于酶切、连接、转化以及 PCR 等。 本实验采用碱变性法微量制备质粒 DNA 。其基本原理是在溶菌酶和 SDS ( 十二烷基磺酸钠 ) 破除细胞壁后，使 DNA 释放出来。在强碱条件下， DNA 变性成单链，当加入醋酸钾溶液适当中和 pH 时，质粒 DNA 能很好地复性，而基因组 DNA 和大分子 RNA 仍为单链，并以蛋白质 -SDS 复合物形式被高浓度盐沉淀。质粒 DNA 留在溶液中，进一步用酚 : 氯仿 : 异戊醇抽提去除蛋白质后，再用乙醇沉淀上清中的质粒 DNA ，并溶解于低离子强度的 TE 缓冲液后，加适量 RNase A 降解残留的 RNA 。 质粒 DNA 的存在形式有 3 种： ① 共价闭环 DNA, 常以超螺旋形式存在； ② 开环 DNA ，此种质粒 DNA 两条链中有一条发生一处或多处断裂； ③ 线性 DNA ，因质粒 DNA 的两条链在同一处断裂而造成。琼脂糖凝胶电泳可以鉴定质粒 DNA ，在电泳时同一质粒 DNA 的 3 种形式泳动速度不同，超螺旋＞线性＞开环。 ? PCR 反应的原理 聚合酶链反应（ polymerase chain reaction ， PCR ）类似于天然的复制过程，用于体外扩增位于两段已知序列之间的 DNA 区段（靶序列），其原理是在模板 DNA 、引物和 4 种脱氧核糖核苷酸存在的条件下，依赖 Taq DNA 聚合酶的酶促合成反应。反应中使用两段化学合成的寡核苷酸作为引物，分别与模板 DNA 两条链互补，待扩增片段的序列位于两条引物之间。 PCR 扩增包括 3 个步骤：（ 1 ）变性（ denaturation ） : 通过加热使 DNA 双螺旋的氢键断裂，双链解离成单链 DNA; （ 2 ）退火（ annealling ） : 当温度突然降低时由于模板分子结构较引物要复杂得多，而且反应体系中引物 DNA 量大大多于模板 DNA ，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板 DNA 双链之间互补的机会较少；（ 3 ）延伸（ extension ） : 在 DNA 聚合酶和 4 种脱氧核糖核苷三磷酸底物及 Mg 2+ 存在的条件下， 5ˊ→3ˊ 的聚合酶催化以引物为起始点的 DNA 链延伸反应。通过变性、退火和延伸的一个循环可以使靶序列数量增加一倍。由于每次扩增的产物又作为下一次扩增的模板，因此，反应产物量以指数形式增长，一个分子的模板经过 n 个循环可得到 2 n 个分子拷贝产物。 pUC18 质粒全序列如下：全长 2686bp 5′- TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGG GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT GCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTC GTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTG TGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTA