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生物电子显微技术作业 课后作业B 简述普通超薄切片的样品制备过程及注意事项。 2.何谓超薄切片？何谓半薄切片？制作半薄切片有什么研究意义？ 由于光镜切片可薄至0.5~2μm，故而又称半薄切片。半薄切片（厚度0.6~0.8μm）的制备，在如今是一种常用制样手段。由于半薄切片图像的清晰度、分辨率远优于石蜡切片，视野也大于超薄切片，所以有利于获得高质量的光镜图像。同时，半薄切片，也是电镜超薄切片技术中一种有效的定位方法。半薄切片被应用于各个方面，如，胚胎学，病理学，等等。可算是应用广泛，是目前较为普遍的一种切片方式。半薄切片制备中的一些关键技术如切片，捞片，脱脂，染色等也不同于石蜡切片和超薄切片，有其特点和难点。 3.常规电子染色有哪些主要方法、技术要点和注意事项？电镜细胞化学染色与常规染色有什么不同？常规电子染色负染色研究以蛋白质为主要成分的颗粒状材料的最常用方法。以某些在电子束轰击下稳定而又不与蛋白质相结合的重金属盐类作为负染色剂，使之在支持膜上将颗粒材料包围，形成具有高电子散射能力的背景，衬托出低电子散射能力的颗粒的形态细节。其所成的电子显微像的反差与常规电子染色相反，即暗的背景和亮的颗粒形态的所谓阴性反差。负染色方法简便，所获得的颗粒的电子显微图像反差强，分辨率也高于超薄切片可广泛用于研究蛋白质分子、细菌鞭毛、蛋白质结晶，以及生物膜及分离的细胞的细微结构，特别适用于蛋白质大分子及病毒颗粒结构的三维重建研究。常用的负染色剂有醋酸铀磷钨酸钠或磷钨酸钾、硅钨酸、铜酸铵及甲酸铀等。用液滴法或喷雾法将颗粒材料的悬液加在载网的支持膜上，然后滴加负染色剂溶液。或将颗粒的悬液与负染色剂按一定浓度混合滴加或喷撒到支持膜上，吸去多余液体，待干燥后，即可用电镜观察。样品颗粒在支持膜上的均匀分散是成功的关键之一。染色剂溶液的 pH 则是成功的另一关键。一般染色剂的 pH 应在中性偏酸范围（pH 5～7），但对不同种类的颗粒材料和染色剂，最适 pH 也不尽相同。 常规电子染色的技术要点： 一般流程为： 醋酸双氧铀染色(清洗(柠檬酸铅染色(清洗晾干 醋酸双氧铀染色 将干净培养皿中加入溶解的石蜡(到培养皿容积的1/3即可)，冷却凝固，制成蜡盘在蜡盘上滴加染液，制成数排小液滴在每个小液滴上放一片载网（有切片的一面朝下），室温下染色20-60分钟用镊子夹住载网边缘，用剪尖的小滤纸片吸掉多余染液在重蒸馏水中缓缓抖动洗涤，换1-2次新重蒸馏水再洗用滴管吸取重蒸馏水轻轻冲洗 柠檬酸铅染色 称取硝酸铅1.33g，柠檬酸钠1.76g，依次放入50mL容量瓶中，加约30mL重蒸馏水，震摇30分钟，使之形成乳白色悬浊液(形成柠檬酸铅)悬浊液中加入8mL 1mol/L的氢氧化钠溶液，使溶液变透明重蒸馏水至50mL定容。充分摇动使之混合(pH12)过滤到棕色试剂瓶中，密封瓶口4℃冰箱保存。 电镜细胞化学染色与常规染色 电子显微镜主要是依赖散射电子成像，为了增强细胞结构的电子反差，需要对切片进行染色。染色是依据各种细胞结构与染色剂（重金属盐）结合的选择性，而形成不同的对电子散射能力，从而产生借以区别各种结构的反差。 免疫电镜技术和电镜放射自显影技术与一般的电镜细胞化学染色有哪些相似和不同之处？你认为在这两种技术的实验操作中哪些是影响样品处理质量的关键步骤？