浅说对生长因子与口腔黏膜的研究(共5430字).docVIP

浅说对生长因子与口腔黏膜的研究(共5430字) 1实验 无菌条件下取行智齿拔除术或牙齿助萌术患者健康牙龈组织，PBS(pH=7.4)彻底冲洗后，加入Dispase溶液2.0-3.0mL，4℃条件下消化过夜；次日，终止消化后，用眼科镊将组织的表皮层与真皮层分离，将真皮层组织剪碎后，加入0.1%Ⅰ型胶原酶2.0-3.0mL，37℃条件下间断震荡消化3h，PBS终止消化后，过筛，1000r/min离心5min后，弃上清，用细胞培养液(DMEM+体积分数10%血清+1%双抗)重悬细胞，在37℃、体积分数为5%的CO2条件下培养三四天，细胞贴壁后换液，以后每两三天换液1次，待细胞融合达到70%-80%时，传代扩增。脂肪干细胞的分离、培养及鉴定：无菌条件下取本院整形外科20-30岁吸脂患者的皮下脂肪5-10mL，PBS彻底冲洗，剔除血管和筋膜后剪碎，0.1%Ⅰ型胶原酶37℃水浴消化，20-30min后终止，过筛、离心后用人脂肪干细胞的专用培养液重悬细胞，接种于25mm2培养瓶中，培养条件同前。待细胞传至第3代时，做流式鉴定(选取的表面标志为CD13，CD14，CD44，CD90，CD105，CD34)和多向诱导分化，成脂诱导14d后，油红O染色；成骨诱导14d后，茜素红染色；成神经元诱导7d后甲苯胺蓝染色。脂肪干细胞条件培养液的制备及蛋白芯片分析：选择生长良好的第3代脂肪干细胞，待细胞融合达80%时，换无血清的DMEM/F12培养基培养48h，收集上清，1000r/min离心5min，保留上清，0.22μm滤膜过滤，分装，-80℃冻存备用。取5mL脂肪干细胞条件培养液，采用蛋白芯片法对其蛋白含量进行检测分析，此法可针对507种细胞因子的含量进行定性及半定量检测，检测步骤及分析方法参考RayBioBiotinLabel-basedHumanAntibodyArrayI说明书(Cat#:AAH-BLM-1-2)。 脂肪干细胞条件培养液中血管内皮生长因子、血小板源性生长因子及碱性成纤维细胞生长因子对口腔黏膜成纤维细胞增殖的影响：选择第3-5代口腔黏膜成纤维细胞，待细胞融合达到70%-80%时，胰酶消化1min，终止消化后将细胞制成浓度为5×107L-1的细胞悬液，种于96孔板中(100μL/孔)，约4h待细胞贴壁后换液，分别设阴性对照组(DMEM/F12)、空白对照组(脂肪干细胞条件培养液)、血管内皮生长因子、血小板源性生长因子以及碱性成纤维细胞生长因子3种因子的浓度梯度实验组(脂肪干细胞条件培养液+1，10，20，50，100μg/L质量浓度的因子)，以及分别加入各上述因子中和抗体的实验组(脂肪干细胞条件培养液+中和抗体)，每组设5个复孔。采用CCK-8法，用酶标仪在光波波长为450nm的条件下，分别于1，2，3，4，5d检测各组的吸光度值(A)，比较在对数生长期(第3天)时各浓度梯度下血管内皮生长因子、血小板源性生长因子以及碱性成纤维细胞生长因子3种因子对口腔黏膜成纤维细胞增殖的影响。主要观察指标：①脂肪干细胞条件培养液蛋白芯片分析结果。②脂肪干细胞条件培养液中血管内皮生长因子、血小板源性生长因子以及碱性成纤维细胞生长因子对口腔黏膜成纤维细胞增殖的影响。统计学分析：实验数据均以x_±s表示，赵佳佳和胡丽应用SPSS16.0统计软件对资料进行分析。多组间差异比较用方差分析，两组间差异比较用t检验，以Plt;0.05为差异有显著性意义 2结果 2.1细胞培养结果 口腔黏膜成纤维细胞扁平，呈梭形，脂肪干细胞原代接种后，由短梭形和多角形逐渐变为长梭形流式检测结果显示人脂肪干细胞高表达CD13(99.49%)，CD44(92.13%)，CD90(97.78%)，CD105(96.82%)，而低表达CD14(1.14%)，CD34(2.71%)。脂肪干细胞成脂、成骨及成神经元细胞诱导及鉴定结果 2.2脂肪干细胞条件 培养液蛋白芯片分析结果检测脂肪干细胞条件培养液中507种因子的信号平均值见表1，其中血管内皮生长因子(信号值SV=360.5)、血小板源性生长因子(信号值SV=363.5)以及碱性成纤维细胞生长因子(信号值SV=389.5)信号平均值均大于300，与阴性对照组比较差异有非常显著性意义(Plt;0.001)。 2.3脂肪干细胞条件 培养液中血管内皮生长因子、血小板源性生长因子以及碱性成纤维细胞生长因子对口腔黏膜成纤维细胞增殖的影响结果显示，脂肪干细胞条件培养液对口腔黏膜成纤维细胞增殖有明显的促进作用，差异有显著性意义(P≤0.05)进一步研究发现，在脂肪干细胞条件培养液中，血小板源性生长因子以及碱性成纤维细胞生长因子对成纤维细胞增殖有明显的促进作用，且随着因子