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生物医学多光谱成像应用(共5639字) 1引言 研究生物体内复杂的生物过程，最直观的方法就是成像技术，如免疫组化、荧光原位杂交技术、细胞成像技术以及活体动物体内成像技术等。由于自发荧光以及光谱重叠的干扰，这些成像方法都只能用一种染料标记特定分子进行成像，即便通过荧光共振能量转移来研究分子间的相互作用，也只能同时有两种染料标记，且无法消除光谱重叠的干扰。生物体内过程的复杂性决定了单色成像用于生物医学研究的局限性，特别是人类基因组计划完成后，研究进入后基因组时代，更加注重基因表达和蛋白质功能信号通路的研究，这些核酸和蛋白质复杂多样，在体内行使着多种多样的功能，传统的单色标记成像已远不能满足研究需求，而多光谱成像（multispectralimaging,MSI）技术，可以去除光谱重叠的干扰，同时标记多个生物分子，对生物体内复杂的物质代谢、信号转导等生物过程能进行实时监测。近年来，随着成像学和光谱学的发展，使得图像被解混（unmixed）成为可能，多种染料标记不同的生物分子，即使存在非常明显的光谱重叠，通过光谱解混也能将每种光学信号彼此分离开来，MSI技术应运而生。本文就MSI技术的基本原理及其在生物医学方面的应用进展做一综述。 2MSI的基本原理 MSI技术是基于成像学和光谱学发展起来的一门新兴技术[1]，它作为一种分析工具，可应用于包括生物医学在内的很多不同的研究领域。多种荧光同时标记时，经过单色光的激发，其多种荧光信号混杂在一起，通过液晶可调谐滤光片（liquidcrys-taltunablefilter,LCTF）对所需波长光进行滤过和电荷藕合元件（chargecoupleddevice,CCD）相机的采集，然后经信号解混系统将采集到的多种混杂的光解混，经过信号输出和显示，可直观地观察到不同颜色标记的生物样品的不同的成分或定位。MSI技术和普通成像技术的最大不同之处，能获得每张图像每个像素点的高分辨率的光谱，而不是肉眼所见的红、蓝、绿三色图像。目前获得光谱的方式主要可通过LCTF技术，LCTF是由一组连续的滤光片组成，它可以和CCD相机等设备很好地配合用于成像。LCTF通过对滤光片的连续调节，可允许很窄（10-20nm）带通的光线通过相机，很快获取不同波长的光谱数据，建立一个三维的“cube”。在这个”cube”里，每种光谱对应每个像素点，然后在不同波长处检测荧光探针或染料在细胞或组织中的分布，快速和精确地进行光谱分类和分离，去除样本的自发荧光，从而显著地改善成像过程，并且同时适合于明视野和荧光的多靶点成像，具备完美的共定位分析功能而且通过计算纯光谱方法学（computepurespectrum,CPS）定量更加准确[2,3]。目前应用较为广泛的成像系统是美国剑桥CRi公司开发的MSI系统，该系统的结构示意图及产品。除了多光谱活体成像系统外，将多光谱成像原理和流式细胞术联合使用而开发出的ImageStream系统也引起广泛关注。该系统整合了流式细胞术和荧光显微技术，结合现代方法学进行成像分析，和流式细胞术相比，该系统可以基于荧光信号同时分析大量细胞的生物学特征并进行数据分析，还提供了形态学数据[4]，如利用该系统可进行细胞凋亡的检测[5]。 3MSI成像特点 组织的自发荧光限制了荧光染料在体内成像的应用，MSI技术的出现使得这一问题迎刃而解。在活体动物中，动物胃肠内容物、皮肤等均有很强的荧光信号，特别是当激发光为蓝色或是绿色时尤为明显，通过利用近红外发射波长的荧光染料，可以减少光的散射，吸收自发荧光，但自发荧光仍然限制着成像的灵敏度，成像依然不理想。而通过MSI，可以消除自发荧光的影响[6]，使得其在多荧光标记和混合标记方面有很好的应用。MSI技术可以适用于各种染料如传统的荧光染料，明视野下的苏木精、二氨基联苯胺等。传统的荧光染料如荧光蛋白，可以很好地用于MSI技术，荧光蛋白作为一种信号报告分子，它们可以示踪细胞位移和亚细胞的生物过程，如基因表达和信号转导等[7]。近年来发展起来的新型荧光探针如量子点（quantumdots,QDs），以其良好的光学特性，尤其适用于MSI系统。QDs具有激发光谱宽而连续、发射光谱窄而对称、荧光强度高是罗丹明6G的20倍、光化学稳定性好是罗丹明6G的100倍以上、耐光漂白、发射光颜色与粒径大小关联等优点，故选用粒径大小不同的量子点，在同一激发波长下，不同的量子点将会呈现不同的颜色，通过CCD相机捕捉，便可很理想地用于多光谱荧光分子成像[8]。 4生物医学的应用 MSI技术的最新进展已使实时表征、生物功能评定和手术中引导成为可能，包括在基础研究和临床应用等相关方面。 4.1基础研究 生物体内蛋白种类繁多，且相互间