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食用菌真菌病害的分离鉴定与防治 　　[摘 要]食用菌污染杂菌中真菌占很大的比重，给菇农及企业造成重大的经济损失，目前对该病害的防治有控制环境因子、药剂防治、生物防治三方面。本文通过形态学鉴定技术结合分子生物技术，确定污染真菌的种类，为以后的生物防治奠定理论基础。 　　[关键词]食用菌;真菌病害;形态鉴定;分子鉴定 　　中图分类号：TU755 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2016）24-0221-01 　　食用菌产业作为我国第六大农作物产业，为人类生活饮食和国民经济都做出了重大贡献。近年来，食用菌是一个非常重要的商品化作物。与其他国家相比，中国是种植食用菌最大及种植种类最多的国家，总计达到全世界种植面积的32%。 　　但在栽培期间由于各种因素使得产量急剧下降。 John Fletcher与Richard Gaze在蘑菇病虫害控制一书中将蘑菇病害分为了五大类：真菌病害，细菌病害，病毒病害，昆虫以及与蘑菇竞争的霉。从某种程度讲，大多数国家，真菌病害是最重要的病害，它能够在任何时间段发生，但其数量种类严重多变。真菌病害不仅污染了食用菌菌棒，使之减产甚至颗粒无收，它自身由次级代谢产物所产生的真菌毒素造成致癌、致畸变、生物紊乱、遗传病变及免疫破坏等作用，从而更加影响了人类对食用菌的食用和药用价值，间接也影响了人类的身心健康问题。本文着重对食用菌真菌病害的鉴定方法进行了阐述。 　　1.食用菌真菌病害的分离 　　1.1稀释平板分离法：在污染菌棒上按比例取三点用分析天平称取样品1g，放入99mL蒸馏水的三角烧瓶，摇床上25℃300r/min摇15min，使样品与无菌水混合均匀;再吸取1ml混匀的液体于新的9ml无菌水试管中，依次稀释到105倍。对稀释10-4、10-5样品试管中吸取1ml液体各三次于灭菌的培养皿中，倒入加有乳酸的孟加拉红培养基，混合均匀后封板，放入恒温培养箱中25℃培养。 　　1.2直接培养法：用无菌镊子挑取病害处的样品，放入加有乳酸的PDA培养基，在25℃恒温培养箱中培养7天，随后用单孢分离法对污染真菌进行再次分离、培养。 　　2.食用菌真菌病害的形态学鉴定 　　将分离菌株接种到直径9cm的PDA平板上，在距离接种部位2cm左右位置倾斜插入经灭菌的盖玻片，然后在25℃培养箱中培养。培养7天时，真菌菌丝体已覆盖的盖玻片上[1]。轻轻取出盖玻片并置于载玻片上，在光学显微镜下观察菌株分生孢子梗及分生孢子着生方式、分生孢子的形态和大小。根据菌落特征及显微形态特征进行菌株种类鉴定。 　　3.食用菌真菌病害的分子生物技术鉴定 　　3.1菌丝体基因组DNA的提取：将分离获得的纯化菌株接种于铺有玻璃纸的PDA培养基上，在25℃培养箱中黑暗培养一周，然后刮取菌丝体置于2ml的无菌离心管中。采用Fastmill-SDS法[2]提取菌丝体基因组DNA。 　　3.2 真菌病害rDNA的ITS和β-tubulin基因序列的PCR扩增 　　将提取获得的菌丝体基因组DNA样品用ddH2O稀释30倍后作为工作液，然后进行rDNA的ITS和β-tubulin基因序列的PCR扩增。扩增引物分别为ITS1-F/ITS4[3]和BT2a/BT2b[4]。ITS-PCR和β-tubulin-PCR的反应体系如下：dNTPs Mix 4.0μL，10×Buffer（含MgCl2）5.0μL，Taq酶（5U/μl）0.5μL，引物各1μL（10μmol/L），1.0μL待测DNA模板 （10ng/μL），ddH2O 37.5μL，总体积50μL。PCR反应条件：94℃/95℃预变性5min，94℃/95℃变性1min/30sec，55℃/52℃退火45s/30sec，72℃延伸1.5min/1min，共35个循环，72℃后延伸10min，于4℃保存。 　　3.3 系统发育数的构建 　　PCR扩增产物送交生工（上海）生物工程股份有限公司测序，将获得的序列登录GenBank获得登录号，经Genbank上Blastn序列比对，用Clustal、BioEdit软件对序列进行匹配和手动矫正，最后使用MEGA6软件中的NJ法通过重复1000次自展法（Bootstrap）检验，进行系统发育树的构建。 　　4. 拮抗实验 　　在冻存管中保存分离的真菌病害菌种，通过打孔器在分离该杂菌的PDA打一菌饼，实验室保存的土壤真菌和食用菌菌种也使用同样的打孔器打一大小相同的菌饼。随后把各个菌饼放至新的PDA培养基上（三者之间各自距离3cm左右），做三个平行组。培养一个星期之后找出生防菌（土壤真菌），它对杂菌进行抑制而对食用菌菌种无影响作用。 　　食用菌病害严重危害食用菌产业的发展，尤为严重的是为了预防食用菌病害的发生，大量喷洒农药制剂