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第十章高效液相色谱法 色谱法分类示意图 概述 一、HPLC与经典LC区别 主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段 二、HPLC与GC差别 相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测 主要差别：分析对象的差别和流动相的差别 2．流动相差别 GC：流动相为惰性气体 组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 HPLC：流动相为液体 流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、 改善分离度增加了因素，对分离起很大作用 流动相种类较多，选择余地广 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性 第一节 固定相和流动相 一、固定相 二、流动相 一、固定相 1. 高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分 为刚性固体和硬胶两大类。 （1）刚性固体以二氧化硅为基质，可承受 7.0?108 ～ 1.0?109Pa的高压，可制成直径、形状、孔隙度 不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团，可 扩大应用范围，它是目前最广泛使用的一种固定相。 （2）硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它 由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为 3.5?108Pa。 2. 固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和全多孔型固定相两类。 （1） 表面多孔型固定相 它的基体是实心玻璃球，在玻璃球外面覆盖一层 多孔活性材料，如硅胶、氧化硅、离子交换剂、分 子筛、聚酰胺等。这类固定相的多孔层厚度小、孔 浅，相对死体积小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较 大，渗透性好，装柱容易，梯度淋洗时能迅速达到 平衡，较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄，最 大允许量受到限制。 （2）全多孔型固定相 由直径为10nm的硅胶微粒凝聚而成。 这类固定相由于颗粒很细（5～10?m）， 孔较浅，传质速率快，易实现高效、高 速。特别适合复杂混合物分离及痕量分 析。 二、流动相 对流动相的要求是： 1. 纯度高 由于高效液相色谱灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要 求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”。 2. 粘度低 若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用 的低粘度溶剂有丙酮、甲醇和乙腈等；但粘度过低的溶剂也 不宜采用，例如戊烷和乙醚等，它们容易在色谱柱或检测器 内形成气泡，影响分离。 3. 化学稳定性好不能选与样品发生反应或聚合的溶剂 4. 溶剂沸点要高于55℃ 低沸点溶剂挥发度大，容易使流动相浓度或组成 发生变化，也容易产生气泡 5. 溶剂要能完全浸润固定相 溶剂对所测定的组分要有合适的极性，最好选择 样品的溶剂作流动相，否则发生溶剂与流动相不相 混溶的情况，使分离变坏 6. 溶剂与检测器匹配 对于紫外吸收检测器，所选择的溶剂在检 测器的工作波长下不能有紫外吸收。 对于折光率检测器，要求选择与组分折光 率有较大差别的溶剂作流动相，以达到最高 灵敏度。 第二节 高效液相色谱仪 high performance liquid chromatograph 一、液相色谱仪器 二、流程及主要部件 一、液相色谱仪器 high performance liquid chromatograph 液相色谱仪（2） 液相色谱仪（3） 液相色谱仪（4） 二、流程及主要部件 process and main assembly of HPLC 高效液相色谱仪流程图 2. 主要部件 高效液相色谱仪由 高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、记录系统 等五大部分组成。 分析前，选择适当的色谱柱和流动相，开泵，冲洗柱子，待柱子达到平衡而且基线平直后，用微量注射器把样品注入进样口，流动相把试样带入色谱柱进行分离，分离后的组分依次流入检测器的流通池，最后和洗脱液一起排入流出物收集器。当有样品组分流过流通池时，检测器把组分浓度转变成电信号，经过放大，用记录器记录下来就得到色谱图。色谱图是定性、定量和评价柱效高低的依据。 （1）高压输液系统 溶剂贮存器 高压泵 梯度洗脱装置 压力表 A. 溶剂贮存器 B. 高压输液泵 续前 高压输液泵，按其性质可分为恒压泵和恒 流泵两大类。 恒流泵是能给出恒定流量的泵，其流量与 流动相粘度和柱渗透无关。 恒压泵是保持输出压力恒定，而流量随 外界阻力变化而变化，如果