分子生物学技术原理及应用分析.pptVIP

基本方法 将DNA标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段； 经碱变性，Tris缓冲液中和，高盐下通过毛吸作用将DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素滤膜上，烘干固定，凝胶中DNA片段的相对位置在DNA片段转移到滤膜的过程中继续保持着。 附着在滤膜上的DNA与32P标记的探针杂交，利用放射自显影术确定探针互补的每条DNA带的位置，确定在众多酶解产物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。 二、DNA链末端合成终止法 目 录 三、DNA自动测序 采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。 DNA自动测序结果举例 目 录 基 因 文 库Gene Library 第 四 节 基因组DNA文库 (genomic DNA library) cDNA文库 (cDNA library) 基因文库 (gene library) 是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。 基因组DNA文库 cDNA文库 第一轮筛选 第二轮筛选 第三轮筛选 基因组文库筛选结果举例 疾病相关基因的克隆与鉴定Cloning and Identification of Disease Relative Genes 第 五 节 克隆疾病相关基因的策略 （一）功能性克隆(functional cloning) （二）定位克隆(positional cloning) （三）非定位候选基因克隆策略(position- independent candidate gene approaches) （四）定位候选基因克隆策略(positional candidate gene approaches ) 定义 从对一种致病基因的功能的了解出发，克隆该致病基因。 （一）功能性克隆 应用 生化机制已明确、基因表达产物较易得到部分纯化的遗传性疾病。 克隆方式 ① 利用特异性抗体筛选表达型cDNA文库； ② 根据已知的部分氨基酸序列合成寡核苷酸作探针，筛选cDNA文库。 功能互补试验 (functional complementation assay) 利用酵母系统从功能学角度鉴定致病基因。 （二）定位克隆 定义 从一种致病基因的染色体定位出发逐步缩小范围，最后克隆该基因。 系统的定位克隆工作 ① 遗传学分析(确定致病基因染色体定位) 交换分析、连锁不平衡分析 ② 分子生物学分析 染色体异常(缺失、易位等)分析、基因文库的筛选与基因克隆 （三）非定位候选基因克隆策略 由于基因组作图的完成和分子病理学的发展，人们可以不依靠染色体定位，直接根据病理学变化和对各种基因产物功能的了解，预测出候选致病基因。 （四）定位候选基因克隆策略 当致病基因的染色体定位确认后，人们可以利用因特网上的基因网站所提供基因序列数据，鉴定出候选致病基因。 * * 常用分子生物学技术的 原理及应用 The Popular Technology in Molecular Biology:Principle and Application 第 一 节分子杂交与印迹技术Molecular Hybridization Blotting Technology 核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex) 。 一、分子杂交与印迹技术的原理 复性 RNA DNA （一）印渍技术 Blotting 首先由Edwen Southern在1975年提出。 Blotting即“印渍”，指将存在于凝胶中的生物大分子转移（印渍）到固定化介质是病加以检测分析的技术，目前广泛应用于DNA、RNA、和蛋白质的检测 探针技术 probe 将一小段已知序列的核酸片段用放射性同位素、生物素或荧光染料对它的末端或全链进行进行标记，称为“探针”然后用于分子杂交，杂交后通过放射自显影、荧光检测或显色技术，使杂交区带显现出来 二、印渍技术的类别及应用 DNA印迹技术 Southern blotting RNA印迹技术 Northern blotting 蛋白质印迹技术 Western blotting 斑点印