14级博士分子生物学实验技术讲义详解.docVIP

博 士 研 究 生 分子生物学实验技术 讲 义 浙江中医学院生命科学学院 目 录 实验一、质粒的提取及纯化 实验二、DNA琼脂糖凝胶电泳 实验三、质粒的酶切及电泳 实验四、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 实验五、PCR扩增及电泳 实验六、目的片段的回收 实验七、哺乳动物组织基因组DNA的提取 实验八、哺乳动物组织总RNA的提取实验九、RT-PCR 实验十、植物基因组DNA提取 实验十一、Sourthern杂交 附录一 、目的片断的回收 实验一 质粒的提取及纯化 小量法提取（碱变性裂解法） 一、实验目的 用碱性SDS方法快速从大肠杆菌细胞中分离、提取质粒DNA，进行琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙啶染色，在紫外灯下检测。通过本实验，学习和掌握质粒的快速提取纯化、技术。 二、实验原理 从大肠杆菌细胞中分离质粒DNA的方法众多，其分离的依据可利用分子大小不同，碱基组成的差异以及质粒DNA的超螺旋共价闭合环状结构的特点来进行。碱变性法抽提效果良好，既经济且得率较高。抽取到的质粒DNA可用于酶切、连接与转化。对于分子量较大拷贝较少的质粒DNA，由于DNA片段较大易于损伤断裂，因此选用氯化铯密度梯度超离心法抽提DNA，具有纯度高，步骤少，方法稳定且获得的质粒DNA是超螺旋构型等特点。对于高拷贝数质粒，用小量制备法抽提质粒DNA就有足够量可用于基因操作。 碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。本实验就是利用碱变性法抽提大肠杆菌中的质粒。 三、仪器、材料与试剂 仪器 恒温培养箱 恒温摇床 台式离心机 高压灭菌锅 制冰机 电泳槽及电泳仪 紫外观测仪 漩涡振荡器 材料 三羟甲基氨基甲烷（Tris） 乙二胺四乙酸（EDTA） 氢氧化钠 十二烷基硫酸纳（SDS） 乙酸钾 冰乙酸 氯仿 乙醇 RNA酶（RNase） 10、苄青霉素（Amp） 试剂 1 LB培养液： 10g氯化钠 10g蛋白胨 5g酵母提取物 补充蒸馏水到990ml ,用5N NaOH调至pH 7.0 补充蒸馏水到1000ml ,120℃高压灭菌30min 2 氨苄青霉素：50mg/ml溶于水 3 氯霉素：34mg/ml溶于乙醇 4 溴化乙锭：10mg/ml溶于水 5 溶液1 50mmol/l Tris .cl PH 7.5 ; 10mmol/l EDTA PH8.0 分别加入下列溶液，定容至100ml, 高压灭菌后，存于4℃ 1mol/l Tris.cl(PH7.5) 5ml 0.5mol/l EDTA (PH8.0) 2ml 6 溶液II 0.4M NaOH ； 2% SDS（现用现配），不能高压灭菌。 使用时0.4M NaOH 和2% SDS等体积混合使用， 使其工作浓度为0.2M NaOH 和1% SDS 7溶液III 1.32mol/l Kac (PH 4.8) 分别加入乙酸钾12.96g ，溶于双蒸水80ml ， 用HAc 调节pH至4.8，定容至100ml，灭菌后存于4℃备用。 8 TE缓冲液 10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0), 高压灭菌。 四：实验步骤 1、 在两只50ml离心管中分别加入10ml含有60ug/ul 氨苄的LB培养液，从两块转化平板上分别挑取单菌落接种于其中，37℃振荡培养过夜。 2、 在1.5ml离心管中加入菌液1.5ml，12000g离心2min，收集细菌沉淀，倒掉上清。 3、 将细菌沉淀中加入预冷的溶液I 200 ul， 剧烈震荡将菌液充分混匀。 4、 加溶液II 200ul （NaOH和SDS用之前等体积混匀），盖严管盖颠倒微型离心管5次以合内容物，温和震荡，至溶液变的澄清，冰浴放置5min。（根据不同菌株可适当缩短） 5、溶液澄清后加入预冷的溶液III 200ul ，温和混匀10s，冰上放置35 min。 6、12000g 4℃离心5 min，取上清移至一个新的Eppendorf管中。 7、 加入等体积的酚/氯仿/异戊