紫外检测法测多胺方法.doc

多胺提取 1、0.1g样品粉末加入1 ml 5 %高氯酸( 加DTT ，V / V ) ，涡旋再冰上放置30 min； 2、12000 rpm 15 min取上清，沉淀再用1 ml 5 %高氯酸冰上提取 30 min 3、离心合并两次上清（注意各样品吸取上清体积要一致），上清液即为多胺提取液（可保存在-80度），提取过程中最好避光，多胺见光易分解； 多胺苯甲酰化： 取提取液到10ml 离心管，加入50ul 二胺（内标，浓度为 1 mmol/L）, 1 ml 2 M NaOH 涡旋，再加10 ul 苯甲酰氯，涡旋20 s, 37度 水浴20 min 加 2 ml 饱和NaCl, 2ml 乙醚 混匀，8000rpm for 5 min 取1 ml 乙醚相，浓缩干燥 25 min 加200-500 ul 甲醇溶解，过滤膜20ul上样检测 1 　仪器和试剂 　　Waters 1500 系列,2487 双波长紫外/ 可见检测器,Breeze 色谱工作软件。腐胺、亚精胺为Fluka产品,精胺为Sigma 产品,甲醇为色谱纯,水为超纯水,其它试剂为国产分析纯。 2 　色谱条件 　　色谱柱: Novapak C18 柱(Waters , 150 ×3. 9mm ,4μm) 。流动相:甲醇∶水(60∶40 , V / V ) ,检测波长为230 nm ,流速0. 7 ml·min - 1 ,柱温30 ℃。 3 　材料处理 　　取植物材料1. 0～2. 0 g ,加入4 ml 预冷的5 %高氯酸( V / V ) 冰浴研磨, 冰浴浸提1 h 后离心(15 000 ×g ,30 min ,4 ℃) 。取500μl 上清液加入10 ml 带盖塑料离心管中,加入7 μl 苯甲酰氯,再加入1 ml 2 mol·L - 1NaOH ,涡漩20 s 后在37 ℃水浴反应20 min。加入2 ml 饱和NaCl 溶液,混匀后用2 ml 乙醚萃取,1 500 ×g 离心5 min 后,取1ml醚相真空干燥,用100μl 甲醇涡旋溶解后过0. 45μm 的滤膜,取10μl 进样。 4 　标准曲线制作 　　将3 种多胺(Put 、Spd 和Spm) 的标准品配成1mmol·L - 1的贮液,各取40μl 按上述方法进行苯甲酰化。分别取苯甲酰化后的多胺标准液0. 03 、0.06 、0. 12 、0. 25 、0. 50 、0. 75 、1. 0 nmol·(10μl) - 1进样,以面积对进样量作曲线,计算曲线方程和相关性系数。 陈建英的方法： 剪取中部叶片，用液氮研磨，取1g样品粉末，加入4 ml预冷的5%高氯酸(V/ V),混匀后冰浴浸提1 h后离心(13200×g,30 min,4℃)。取500μl上清液加入10 ml带盖玻璃离心管中,加入10μl苯甲酰氯,再加入1 ml 2 mol/L NaOH，涡漩20 s后在37℃水浴反应25 min。加入2 ml饱和NaCl溶液，混匀后用2 ml乙醚萃取,1 500×g离心5 min后,取1ml醚相氮气吹干,用500μl甲醇涡旋溶解后过0.45μm的滤膜,取20μl进样检测。用岛津LC-20A型高效液相色谱仪测定, 色谱柱:C18柱[kromasil，250×4.6mm，4□m],流动相:甲醇:水[60:40，V/V]，检测波长为230nm，流速0.8ml/min，柱温25℃。 罗园的方法： 1.3.1 多胺的测定 1.3.1.1 仪器与试剂 瓦里安（VARIAN）高效液相色谱仪VARIAN 01223UV-VIS Detector, VARIAN 00875 HPLC pump, VARIAN Autosampler)。Put（纯度99%）为Aldrich公司产品，Spd（纯度≥99%）为Fluka公司产品，Spm（纯度≥97%）为Sigma公司产品，甲醇为Fisher进口色谱纯，水为超纯水，其他试剂为国产分析纯。 1.3.1.2 色谱条件 色谱柱：Hypersil ODS2 5 μm分析柱（4.6 mm×150 mm），流动相为甲醇：水（体积比为64：36），等梯度洗脱，流速为0.7 ml/min，进样量为30 μL，检测波长：230 nm，柱温为30 ℃。采用外标法定量。 1.3.1.3 提取、纯化条件 参照刘俊等（2002）略有改动：取液氮研磨后叶样粉末0.5 g于塑料离心管中,加入5 mL 5%预冷高氯酸，涡旋5 s，于4 ℃，超声波振荡30 min后冰浴浸提1 h，在4 ℃，12000 g下离心30 min，收集上清液500 μL转入塑料离心管中，加入7 μL苯