引物测序专题手册.PDFVIP

引物/测序专题手册 引物合成服务：400-025-8686-5812 oligo@ 测序服务：400-025-8686-5813 seq@ ◎ 引物专题 ◎ 测序专题 ◎ 常用生物信息学工具 知识荟萃，答疑集锦，专家云集，助您科研一臂之力！ 联系方式 地址：江苏省南京市江宁科学园雍熙路28号 (211100) 电话：400-025-8686 025传真：0255815 网址： 测序专题 1. 知识荟萃 1.1 测序用引物说明 1.2 测序对样品的要求 2. 测序服务简介 3. 常见问题解答 3.1 常见峰图原因分析及解决方案 3.2 测序答疑 公司简介 金斯瑞是您可靠的基因、多肽、蛋白和抗体研究伙伴，帮助进行基础生命科学研究，生物药研究以及早期药 物开发。自2002年成立以来，金斯瑞发展迅速，已成为全球领先的生物技术公司，公司总部位于美国新泽西州， 在欧洲、日本和中国均设立了分公司。金斯瑞一直致力于为全世界的科研机构提供最好的研究服务，已经为全世 界100多个国家的科学家提供了生命科学研究产品和服务。我们已经建立了最佳通量和质量的生物学研究服务， 包括基因合成，分子生物学服务，多肽合成，定制抗体，蛋白表达，抗体及蛋白质工程以及体外和体内药效学研 究，所有的目标都是希望让科研变得更加简单。 金斯瑞始终以提供最好的质量给客户，为客户的利益服务为理念。基于这个理念，我们的管理体系经过了 ISO9001:2008认证，提供的产品达到cGMP水平，同时通过了AAALAC及OLAW认证，努力为客户提供最好的服 务。同时，为不同的客户提供不同的商业合作模式，包括项目模式，定向全时制模式，战略合作联盟模式。 目 录 13 13 16 18 18 18 19 常用生物信息学工具 1. 分子生物学/基因设计软件 2. 测序峰图阅读软件 3. 引物设计相关软件 4. siRNA相关软件 5. DNA Star介绍 23 23 23 23 24 引物专题 1. 知识荟萃 1.1 引物设计 1.2 PCR设计引物时酶切位点的保护 1.3 引物纯化方式选择指南 2. 引物合成服务简介 3. 常见问题解答 3.1 引物合成及纯化 3.2 引物的定量、保存和溶解 3.3 引物的纯度及使用中的常见问题 1 1 2 5 7 7 7 8 10 - 1 - - 2 - 引 物 专 题 您的创新药物研发伙伴 1. 知识荟萃 1.1 引物设计 1) 常规PCR引物设计 ① 引物长度： 15~30 bp，常用为20 bp左右； ② 引物扩增跨度： 以200~500 bp为宜，特定条件下可扩增长至10 kb的片段； ③ 引物碱基：G+C含量以40~60%为宜，过高或过低都不利于PCR反应，上下游引物的GC含量不能相差太大。 ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列； ④ 避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的 扩增条带； ⑤ 引物3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败； ⑥ 引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处； ⑦ 引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性； ⑧ 引物量：每条引物的浓度约在10~100 pmol之间，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错 配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。 2) 测序引物设计 引物的正确设计是测序反应成功与否的一个关键条件之一，由于测序反应的特殊要求，普通PCR反应中可成功地特 异、高效扩增目的DNA片段的PCR引物并不一定总是适合作为循环测序反应的引物。测序反应引物的设计与普通引物一 样，是在扩增特异性和扩增效率两个目标之间取得平衡。但一般来说，测序引物的设计原则要比普通PCR引物严格些， 测序引物的设计一般应遵循下述原则： ① 长度在15~25个碱基左右，一般选择20个碱基 (根据GC含量作适当调整)，3端尽量选择G或C碱基 (但不绝对)，以 增加与模板的结合能力； ② Tm温度应选择50~70℃左右； ③ GC含量应选择在50%左右，尽量避开A、T、G、C的连续结构； ④ 避开引物自身形成发夹结构或引物二聚体结构等复杂结构； ⑤ 保证引物和模板100%匹配，特别是3端的几个碱基一定要100%匹配。同时必须严格保证引物和模板之间只能有 一个结合位点。 3) Real Time PCR引物设计 实时荧光PCR有染料法和探针法两种。染料法只需设计引物而探针法除设计引物