超速离心分离蛋白多聚体.docxVIP

水平转头也称吊桶式转头。静止时离心管垂直挂在转头上，当转头转速达一定速度后达到水平位置，通常转头的吊桶要满挂。水平转头结构比较复杂，容量也相对小一些。 角转头的离心管腔与转轴保持固定角度。由于结构稳定，可装载较多的样品和使用较高的转速。上样量与离心转头和离心管的选择都有关。我们实验室就有一台BECKMAN超速离心机，配有水平转头和角转头，角转头最高转速可达70 000转，水平转头最高转速也可达60 000转（所以超速离心并不都是角转的），各自配备的离心管容量相差也很大。本实验室：28000rpm/min，18h，蔗糖梯度40%-70%，每管容量大概35ml，其中蔗糖密度梯度32.5ml，样品2.5ml（管子必须装满，否则会离碎。样品只与体积有关，浓度越高，可提高上样量），目的是为了分离四聚体（240KDa）和三聚体(180KDa)。离心18h后，分管收集，每管3.5ml左右，切记从最底部缓慢用针管吸出或用泵泵出。之后透析挂柱子。密度梯度离心基础余兴明中科院上海生物化学研究一、概论　　在密度梯度离心中单一样品组份的分离是借助于混合样品穿过密度梯度层的沉降或上浮来达到的。梯度液的密度随着离心半经的增大而增加。密度梯度可以予形成，也可以在离心过程中自形成，经常，密度梯度的可以分为：速率一区带（Rate-30nal）离心和等密度（Isopycnic）离心。　　在速率一区带离心中混合样品的以很薄的一层铺在梯度液的上部，在离心过程中由于不同组份颗粒在梯度液中沉降速率的差别，而在离心的某一时刻形成了数个含有第一级份颗粒的区带。离心过程在最垂的样品（或者说沉降得最快的样品）形成沉淀前就停止了。样品在离心后与梯度液一起收集，用常规技术去除梯度材料后就得了某个较纯的成份。每个单一组份的沉降速率取决于它们的形状、尺寸、密度、离心力的大小、梯度液的密度和粘性系数。　　对于相类似的生物体组份常常形状也相似。在速率区带离心中我们常使梯度液的最大密度不超过样品在该梯度中浮密度。利用这类生物组份在尺寸上的差异的形成的沉降速率的不同，选择某一特定时刻，当它们中的各个纯样品区带之间的距离拉得最远时停止离心即可以达到分离目的。　　与速率一区带离心法不同的是，等密度离心是依赖于样品颗粒的不同密度来进行离心分离的。混合样品可以铺在梯度液之上，也可以置于梯度液之下，甚至和梯度液混在一起。最后一种方法依靠离心力来形成梯度（自形成梯度）在形成梯度的过程中由于样品各单一成份向它们自己的等密度区靠扰即达到了分离纯化的目的。对于速率一区带离心，梯度液最大密度一般小于样品中各组份的密度，也就是说是在样品正在沉降过程中的不是在形成沉殿后来分离样品；而等密度离心法中，梯度液的初始最大密度常常超过样品各组份的密度，利用每个单一组份沉降或上浮到它们各自的等密度区来达到分离的目的。密度梯度离心法的理论依据是（参考文献1）每种纯样品成份在梯度液中的沉降速度可以表达为：V=d2÷18×(σ-s)÷η×ω2r式中V是某一时刻样品的沉降速度（厘米/秒）d：样品颗粒的直径（厘米），我们在初步计算时就假说样品颗粒为球体。非球形颗粒样品，可以以上式为基础进行修正。σ：样品颗粒的密度（克/厘米3）s：密度梯度液的密度（克/厘米3）η：密度梯度液的粘性系数（克/厘米·秒）ω：离心机重轴的旋转角速度（1/秒），ω=2πN÷60，N：转/分r：颗粒所在位置与旋转轴心之间的距离，即离心半径（厘米）σS时 V0即样品顺离心力方向沉降σS时 V0即样品逆离心力方向上浮σ=S时 V=0即样品停止沉降或上浮，稳定在这一位置用这个公式可以很好地解释在速率一区带离心法或等密度离心法中单一样品的沉降（或上浮）行为。二、转头的选择：1、离心转头分类：转头类别使用的离心机发明时间、发明者或推广商固定角式转头低、高、超 1943年，（英）Pickels甩平转头低、高、超速 1951年，（德）Kahler垂直管转头高、超速 1974-1975年，（美）Dupont公司区带转头低、高、超 1964-1965年，（英）Anderson、（英）MSE公司近垂直管转头超速 1989年，（日）Hitachi Koki、（美）Beckman公司连续离心转头低、高、超 1965年，（英）MSE公司其他特种转头：分析转头，土壤脱水转头，细胞浮选转头，管式转头，血球比测定转头，细胞清洗转头等等。2、各种转头用于密度梯度离心的比较：（I）各种转头用于速率一区带（R-z）离心的优缺点分析：　　固定角式转头：壁部放应影响很大，用于R-z离心回、收率低，纯度也受影响一般知用于差分离心和等密度离心，离心时间向较短。是各其离心机的最高速转头。　　甩平转头：细长离心管用于R-z离心可以获得较高纯度和高分辨率，且容易控制离心时间，壁部入在很少。25000rpm~3000