蛋白质的分离与纯讲述.ppt

蛋白质的分离与纯化 Selection of protein source 蛋白质原料的选择 ? 选含“目的”蛋白多的原料。 ? 选来源广、容易得到的原料。 ? 用重组DNA技术（recombinant DNA technique）获得大量稀有蛋白质。 常用的中性盐有：硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等。 盐析时，溶液的pH在蛋白质的等电点处效果最好。 盐析沉淀蛋白质时，通常不会引起蛋白质的变性。 分段盐析： 半饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆球蛋白，而饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆清蛋白。 （二）有机溶剂沉淀蛋白质： 凡能与水以任意比例混合的有机溶剂，如乙醇、甲醇、丙酮等，均可用于沉淀蛋白质。 沉淀原理是：① 脱水作用；② 使水的介电常数降低，蛋白质溶解度降低。 为了防止蛋白质在分离过程中发生变性，有机溶剂浓度不能太高(30%-50%)，而且需要在低温条件下进行。 （三）层析： 层析（chromatography)是一种利用混合物中各组分理化性质的差异，在相互接触的两相（固定相与流动相）之间的分布不同而进行分离分析的技术方法。 主要的层析技术有离子交换层析，凝胶层析，吸附层析及亲和层析等。 Gel filtration chromatography 凝胶过滤层析（1） ? 凝胶过滤层析(分子排阻层析，分子筛层析): 以具有分子筛效应的颗粒状多孔网状物质为支持物,根据分子大小和形状不同分离物质的技术。 ? 基本原理：大的分子不能进入多孔凝胶颗粒内部，从颗粒间隙穿过，行程短，被先洗脱下来；较小的分子可以进入凝胶颗粒内部，路径迂回曲折，行程长，后洗脱下来。 Gel filtration chromatography 凝胶过滤层析（2） ? 几个重要参数: 某一溶质组分的洗脱体积:Ve 凝胶床总体积: Vt 凝胶自身的体积: Vm 颗粒内部的水体积(内水体积): Vi 颗粒外的水体积(外水体积): V0 四者关系: Vt =Vm+Vi+V0 Gel filtration chromatography 凝胶过滤层析（3） 某蛋白质的洗脱体积: Ve 当某蛋白质完全不进入颗粒内部时: Ve=V0 当某蛋白质进入颗粒内部全部孔径时: Ve=V0+Vi 当某蛋白质进入颗粒内部部分孔径时: Ve=V0+Vi ?Kd Kd = (Ve- V0)/Vi ? 应用 1)分离纯化蛋白质; (现主要用作粗分) 2)脱盐; 3)测定分子量; Gel filtration chromatography 凝胶过滤层析（4） ? 测定分子量的原理和方法 物质分子的分子量大小与洗脱体积(Ve)有关,反过来可根据某物质的Ve或Ve/V0推测出其分子量。 1）制作标准曲线 2）待测样品过柱或 与标准物质混合过柱。 测定其Ve和V0值。 查标准曲线。 Ion exchange chromatography 离子交换层析（1） ?离子交换: 溶液中的某种离子与另一种带静电结合在不溶性载体上的离子进行可逆交换的过程。 ?离子交换剂：能与溶液中的正离子或负离子进行交换的物质。由不溶性载体上共价连接可电离的基团制成。 1）阴离子交换剂：不溶性载体上共价连接着带正电荷的基团，吸附和交换周围介质中的负离子。如，DEAE-纤维素（diethylaminoethyl，二乙基氨基乙基）。 -R+Y- + X- ? -R+X- + Y- （Y为平衡离子） 2）阳离子交换剂：不溶性载体上共价连接着带负电荷的基团，吸附和交换周围介质中的正离子。如 ，CM-纤维素（carboxymethyl，羧甲基）。 -R-Y+ + X+ ? -R-X+ + Y+ （Y为平衡离子） Ion exchange chromatography 离子交换层析（2） ? 基本原理： 根据物质的电离性质差异进行分离。被分离物质的离子与离子交换剂上的平衡离子进行交换，然后用适当的洗脱液进行洗脱。由于各种被分离的物质离子的净电荷量不同，与载体上与可解离基团的结合力大小不同，所以被先后洗脱下来。 ? 洗脱方法： 1）盐梯度洗脱法（pH一定）； 2）pH梯度洗脱法； 逐步升高pH：阳离子交换剂；低pH上样。 逐步降低pH：阴离子交换剂，高pH上样。 3）同时采用盐梯度和pH梯度洗脱； Ion exchange