SangerDNA测序原理.pdf

DNA测序原理 钱晓霞 Field Application Specialist Tel: 800 820 8982 / 400 820 8982 cnmcbSupport@ Agenda 测序原理 DNA测序的设备 DNA测序的试剂 DNA测序的软件 2010年8月13日星期五 ? 2009 Applied Biosystems. 2 测 序 原 理 2010年8月13日星期五 ? 2009 Applied Biosystems. 3 Fred Sanger Leroy Hood 2010年8月13日星期五 ? 2009 Applied Biosystems. 4 DNA分子组成 碱基 A G Adenine Guanine CT CytosineThymine戊糖（脱氧） 脱氧核糖核苷 2010年8月13日星期五 ? 2009 Applied Biosystems. 5 DNA分子组成 碱基 脱氧核糖核苷酸dNTP A G Adenine Guanine 磷酸 CT CytosineThymine戊糖（脱氧） 脱氧核糖核苷 2010年8月13日星期五 ? 2009 Applied Biosystems. 6 Sanger测序－－双脱氧末端终止法 unlabeled primer dATP, dCTP, dGTP, dTTP ddCTP ddATP + ddGTP template DNA ddTTP 2010年8月13日星期五 ? 2009 Applied Biosystems. 7 双脱氧末端终止法 ddNTP被加到正在合成的链上 由于它的3’-OH已被氧化 下一个 ， ， dNTP的5’-磷酸基团不能与之形成磷酸二酯键，使合成终止。 在引物等延伸反应过程中，ddNTP在不同位置掺入，产生了一系列 不同长度的新的DNA片段。 2010年8月13日星期五 ? 2009 Applied Biosystems. 8 DNA测序循环反应与普通PCR扩增的区别 测序只用一条引物； PCR需两条引物 测序产物线性扩增； PCR产物指数扩增 测序需要dNTP和ddNTP； PCR只用dNTP 测序产物是长度相差 产物是长度相同的 种片段一 PCR 一 个碱基的一系列片段； 2010年8月13日星期五 ? 2009 Applied Biosystems. 9 DNA sequencing：Chemistry template + polymerase + dCTP dTTP dGTP electrophoresis dATP ddATP ddGTP A?T G?C ddTTP ddCTP A?T T?A C?G T?A G?C extension G?C A?T G?C T?A T?A C?G DNA测序的自动化 2010年8月13日星期五 ? 2009 Applied Biosystems. 10 T?A G?C A?T 基因分析仪的基本构造 CCD 相机记录所有通道信号 计算机分析测序数据 激光激发所有通道 毛细管 电泳方向 高压电源 2010年8月13日星期五 ? 2009 Applied Biosystems. 11 DNA测序示意图 C T T G C A T G A C 序列 用点的大小代表DNA分子的大小， 颜色代表DNA所标记的颜色 信号 。 检测窗口 毛细管 2010年8月13日星期五 ? 2009 Applied Biosystems. 12 进样端 DNA测序的设备 2010年8月13日星期五 ? 2009 Applied Biosystems. 13 ABI公司书写基因分析仪历史 3730(xl) 1986年 全球第一台 基因分析仪 370 373 377 310，3100(A) , 3130（xl），3500( xl ) 1996年全球第一台 细管基 分析仪 310 毛 因 平板胶电泳 毛细管电泳 2010年8月13日星期五 ? 2009 Applied Biosystems. 14 ABI公司基因分析仪发展历史 1986年 370型全世界第一台基因分析仪 1991年 373型基因分析仪 1995年 377 型基因分析仪，光栅+CCD 310型毛细管基因分析仪 1997年 377-96基因分析仪 1998年 3700型 96道毛细管基因分析仪 2000年 3100 16道毛细管基因分析仪 2002年 3100 Avant 4道毛细管基因分析仪 2002年 3730 48道毛细管基因分析仪 3730xl 96道毛细管基因分析仪 2004年 3130 4道毛细管基因分析仪 3130xl 16道毛细管基因分析仪 2009年 35