动物分子生学实验.doc

实验一 分子生物学仪器的使用及原理 一、 实验目的 1.学习认识分子生物学实验室的仪器设备 2.了解分子生物学仪器设备使用的注意事项 二、主要仪器设备 1. 普通离心机 2. 无菌操作台 3. 高速冷冻离心机 4. PCR仪 5. 恒温振荡摇床 6. 真空干燥箱 7. 恒温水浴锅 8. 紫外分光光度计 9. 微波炉 10. 微量移液器 11. Eppendorf管 12. 高压灭菌锅 13. 电泳仪 14. 凝胶成像系统 15. 紫外仪 三、实验报告要求 写出分子生物学主要仪器设备的使用注意事项 实验二：质粒（pEGFP-N1）的提取与酶切 一. 实验目的 1.了解碱裂解法提取质粒的基本原理和主要应用，掌握碱裂解法提取质粒的实验方法和各种试剂在提取过程中的作用。 二. 实验原理 碱裂解法是利用细菌染色体DNA与质粒DNA结构的大小差异来分离质粒DNA的。碱性（pH 12.0～12.5）条件可以破坏碱基配对，宿主和质粒DNA的碱基之间的氢键被破坏。当条件恢复正常时（加入酸性试剂中和），共价闭合环状的质粒DNA会迅速准确地恢复配对，重新形成完全天然的超螺旋分子；而较大的细菌染色体DNA分子则难以复性，会交联形成不溶于水的线团结构，缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀下来，而质粒DNA则留在上清液中，用异丙醇沉淀、70 %乙醇洗涤即可获得质粒DNA。 三. 仪器设备 微量取液器（2 μL；20 μL；200 μL；1 000 μL），tip头，手掌型离心机，1.5 mL离心管, 恒温水浴，制冰机，超净工作台，恒温培养箱。振荡器，离心机，金属浴，电泳仪，凝胶成像仪。 四．实验试剂 1.溶液Ⅰ：50 mmol/L葡萄糖；20 mmol/L Tris·HCl（pH = 8.0）；10 mmol/L EDTA（pH=8.0），高压蒸汽灭菌（121 ℃，0.105 Mpa）20 min。4 ℃贮存。 2.溶液Ⅱ（现用现配）：0.2 mol/L NaOH；1 g / L SDS。 3.溶液Ⅲ（pH 4.8）：每100 mL溶液中含5 mol/L乙酸钾60 mL；冰乙酸11.5 mL；H2O 28.5 mL。 4.RNase（10 mg / mL），LB液体培养基，氨苄青霉素，异丙醇，70 %（V / V）乙醇，无菌水。 五.实验步骤： 1.提取步骤： 1) 挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于3-5mlLB（含氨苄）液体培养基中，37℃振荡培养12-14小时。 2) 取上述培养物移入1.5mlep管中，室温以8000r/min离心5分钟，弃上清，再加1.5ml上述培养养物于ep管中，室温以8000r/min再离心5分钟。 3) 弃上清液，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。 4) 加溶液Ⅰ100μl，用力弹ep管，使菌体分散均匀；加溶液Ⅱ200μl，颠倒数次混匀（不要剧烈振荡），并将离心ep管放置于冰上5分钟，使细胞膜裂解（溶液Ⅱ为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）。 5) 加入150μl预冷的溶液Ⅲ，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置10分钟。（溶液Ⅲ为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀。）然后，室温以12000r/min离心5分钟。 6) 抽取上清液于一新微量离心管（ep管）中，加无水乙醇900μl，冰浴20分钟，室温以13000r/min离心10分钟，放入净化工作台用风机吹干，加TE，定容至30μl，再加RNA酶5μl，37℃水浴30分钟。（-20℃保存备用） 酶切步骤： 1) 制胶：1%琼脂糖电泳：琼脂糖0.5克，TBE50毫升放电炉上使之融化，温度降到50摄氏度时加入EB冷凝后倒胶，30分钟后凝固，拔去梳子。 2) 加样：取已转化的感受态细胞溶液10微升，再加5微升上样液。 3) 电泳：电压40V和电流50mA 条件下，50分钟后用紫外灯观察（有无条带），若有条带跑出，进行抽提。 ①加TE400微升、酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）400微升，用力弹匀。室温下，12500rpm离心10分钟。观察到液体分三层，取上层液于一新灭菌过的EP管中，再加氯仿400微升，然后室温下，12500rpm离心10分钟。 ②取上清液，加无水乙醇900—1000微升、乙酸铵100微升，用力震荡。-20摄氏度下放置1-1.5小时，然后室温下，13000rpm离心5-10分钟。 ③弃去上清液，加75%的酒精混匀。室温下，12500rpm离心5分钟。 ④弃去上清，把EP管放入净化工作台用风机吹干后，用TE定容至30微升。 4) 酶切：30微升体系取上述液体15微升，加 多组分缓冲液 3微升 BSA 3微升