胶体电泳分析DNA片段-台中高农.doc

PAGE 14 PAGE 15 膠體電泳分析DNA片段 國立中興大學植物病理系 張碧芳 助理教授 前言 核酸電泳主要利用核酸帶負電荷的特性，於電場中會穿過膠體，如：agarose或polyacrylamide膠體，而朝向正極移動。因為不同分子量的核酸，在膠體孔徑中移動的速度會有差異，藉此將不同大小的核酸分開。Agarose膠體為較普遍用為電泳的材料，主要因為其製備方便及簡單，常使用在200 bp~50 kb核酸片段間的分析，且通常以水平式電泳槽來進行電泳。然而，polyacrylamide膠體的製備相較於agarose膠體則較為麻煩，且未聚合前之acrylamide具有神經毒性，可經由皮膚或黏膜吸收，在操作上更應小心。Polyacrylamide膠體電泳可有效分析小分子量的核酸片段，甚至小至1 bp，如：核酸定序，一般以垂直式電泳槽來進行。 膠體電泳的解析力 膠體電泳可分析小至數個核苷酸，大至百萬個核苷酸的染色體DNA，但它也有一定範圍的解析力，並不是一片膠體就可分析各種大小的DNA片段，故要得到好的解析力，必須要探討膠體電泳的解析範圍。常用於分析DNA的膠體電泳有兩種，一種是洋菜凝膠電泳（agarose gel electrophoresis，簡稱AGE），另一種為聚丙烯醯胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，簡稱PAGE）。這兩種凝膠，由於其濃度不同時，所形成之凝膠體的孔洞不同，故其解析範圍不同。對直線形DNA的有效分析範圍，洋菜膠常用0.3%至2.0%之濃度，可分析於1~60 kb（kilo-base pairs或kilo-base）DNA分子（見表一），而聚丙烯醯胺凝膠常用濃度為2.5%至20%，可分析1~1000 base或base -pair（bp）長度之DNA（表二）。 （資料來源：曾等，1987）（資料來源：曾等，1987） 洋菜凝膠的製備非常簡單，又沒有丙烯醯胺的毒性，故為最常用的膠體，但AGE只適合於分析較大片段的DNA，故在1 kb左右或更小的DNA片段，就只好用較不易操作的PAGE。有時為了增加1 kb左右DNA的解析範圍，也有使用洋菜凝膠與聚丙烯醯胺凝膠混合膠體作電泳，但其操作更麻煩，而且會因凝聚情況不同而得到誤差的結果。為了方便分析1 kb以下的DNA片段，1980年代美國FMC公司製產一種洋菜凝膠，稱為NuSieve agarose，它可配製成1~9%之凝膠，以分析較小片段之DNA分子，其解析??極佳，依不同的凝膠濃度而有不同之解析範圍（見圖一及圖二），但所使用的電泳緩衝液種類也會影響凝膠之解析範圍（見圖一A、B及圖二A、B之比較）。一般常用之電泳緩衝液有三種，其配方如表三，其中以TAE及TBE最常用。選用TAE或TBE緩衝液，對大多數電泳結果，並不造成太大的差異，但某些樣品的分析，有時卻有極大的差異， （資料來源：曾等，1987） （資料來源：曾等，1987） （資料來源：曾等，1987） 前述用NuSieve膠體電泳，只是DNA泳動距離（或稱速度）之差異而已，對所得結果之判讀，還不會造成誤差。不過，如果想把AGE分離之DNA片段回收再分析，則必須選用TAE進行電泳，否則對DNA回收率有影響，相反的，分析單股DNA時，卻常選用TBE。 電泳技術使用至為方便而可靠，但在分析DNA分子上，一直無法達到分析較大分子的染色體DNA，因此，多年以來，進行基因在染色體上定位的研究，完全依賴遺傳分析或配合顯微鏡的定位分析。最近幾年，由於對電泳電場的試驗分析，已經開發可以用AGE作為分析大於100 kb DNA分子。以酵母菌染色體DNA所作分析結果，酵母菌內其中16條染色體之DNA大小在200 kb至1500 kb間，經由改變電場中電極於某一角度下交互轉換通電之結果，可以達到分離多數染色體DNA的目的，這些設計，包括一種稱為OFAGE（orthogonal-field-alternation gel electrophoresis），其設計主要是電極以（90°）直角交互對換通電。另一種稱為FIGE（field-inversion gel electrophoresis），為定期將電極作180°轉換，其方式如向前電泳2秒鐘，向後電泳1秒鐘之交換進行。而最好的設計，目前以CHEF（contourclamped homogeneous electric fields）電泳，可得到最好的解析力，其設計主要為一六角形之電泳槽之六邊上，圍繞上電極，以120°角度交互作電泳。上述這三類之電泳設計，即為一般所稱之脈衝電泳（pulsed field gel electrophoresis），而電泳中之脈衝交互通電之角度以120度之解析力似乎最好。 影響電泳的因素