蛋白质荧光染色技术.ppt

第七章 定量蛋白质组学研究技术; 定量蛋白质组学 (quantitative proteomics): 顾名思义，就是把一个基因组表达的全部蛋白质或一个复杂的混合体系中所有的蛋白质进行精确的定量和鉴定的一门学科。 ;传统的技术 传统的对蛋白质组研究的途径是分离—鉴定。对一个蛋白质混合体系，首先用二维凝胶电泳进行分离，然后对蛋白质点进行染色，最后通过比较蛋白点染色强度，对其进行定量分析。;理想的染色方法必须有以下几个特点： 1.具有良好的线性范围 2.具有好的通用性 3.具有高的灵敏度 4.染色不影响后续的鉴定过程; 但是 1. 采用考马斯亮蓝染色法或银染法，都不能 完全符合上述的几点特征，也就不能准确 地应用于定量蛋白质组学研究; 2. 质谱只应用于对未知蛋白点的鉴定，而不能 应用于对蛋白质点的定量分析，这是因为不 同的蛋白质或多肽具有不同的离子化能力， 所以不能够通过质谱图对蛋白质或多肽进行 定量分析。; 新的技术 1.荧光染色（标记）技术与考马斯亮蓝染色 法或银染法相比，能更好满足于上述几点 要求，从而能够应用于定量蛋白质组学研究 2.稳定同位素代谢标记的方法和同位素亲和 标签技术巧妙解决了质谱仪不能应用于对 蛋白质点的定量分析的缺点;第一节 利用荧光染料进行 定量的蛋白质组分析技术;Amersham 2D-DIGE;第二节 运用质谱进行定量的蛋白质组分析技木; The labelling can also be achieved by digesting two protein sample with trypsin in 18O and 16O water;二.同位素亲和标签技术;试剂有两种形式，称为“重”和“轻” ;Cell States Normal vs. Diseased Aerobic cells vs. Anaerobic cells,etc. Lyse cell and digest with trypsin Avidin-Biotin Separation Single MS Analyze peptide peak ratios MS/MS Obtain sequence info;Examples of Real Data using ICAT;优点：ICAT具有广泛的兼容性;当然， ICAT技术依然存在一些问题：; 结 语 随着蛋白质组学研究的不断深入和发展，定量蛋白质组学已成为当前研究的热点。目前定量蛋白质组研究的一个主要内容是研究在不同细胞状态下蛋白质的差异表达，特别是一些低拷贝蛋白质(如一些激酶和信号转导分子)。在这种倩况下，研究者不仅要注重在不同细胞状态下蛋白质表达量的相对变化，还要注意其所用技术能定量的范围界限。虽然在这方面已取得了一定的成功，但是所有的这些定量技术都只是一个相对的定量，还没有一个可以获得细胞或组织中蛋白表达的绝对的准确量的技术；其次，目前所用的这些技术也不是很完善，仍需不断的改进和创新。