脊髓神经元凋亡上调生长相关蛋白-43参与神经病理性疼痛.doc

中青年优秀论文评奖 Caspase-3凋亡通路上调生长相关蛋白-43参与神经病理性疼痛 吴飞翔　缪雪蓉 孙玉明　俞卫锋 第二军医大学东方肝胆外科医院麻醉科，上海，200438 通信作者：俞卫锋，E-mail： HYPERLINK mailto:ywf808@ ywf808@ 摘要： 背景及目的：神经病理性疼痛机理不明，治疗效果差，为世界性难题。神经损伤后，细胞发生凋亡，但细胞凋亡是否与神经病理性疼痛有关？凋亡的是神经元还是星型胶质细胞仍存在争议，神经元凋亡后为何还有痛觉信号传导？为了对神经病理性疼痛的细胞凋亡机制进行研究，我们采用RNA干扰的方法以及caspase－3抑制剂来阻断caspase－3凋亡通路，观察caspase－3凋亡通路是否参与神经病理性疼痛，以及caspase－3凋亡通路对芽生形成的重要蛋白生长相关蛋白-43的影响。方法：大鼠分成4组:假手术组(Sham组，n=18)，生理盐水组(NS组，n=18)， caspase-3抑制剂Z-DEVD-FMK组（DEVD组，n=18），以及caspase-3 RNA干扰组（siRNA组，n=18）。Sham组不结扎坐骨神经，DEVD组结扎坐骨神经，并在手术前及术后每日鞘内注射1U/30μl的Z-DEVD-FMK，连续注射5d。siRNA组结扎坐骨神经，并在手术前及术后每日鞘内注射10μg/30μl的caspase-3小RNA，连续注射5d。NS组则结扎坐骨神经，鞘内注射30μl生理盐水。各组分别于CCI前及术后1d、2d、4d、5d、6d、7d、10d测定各组大鼠热痛阈，并采用免疫荧光、Western blotting、实时荧光定量PCR方法测定caspase-3蛋白及mRNA的表达表达，TUNEL 原位末端标记法检测脊髓神经细胞的凋亡。同时，行caspase-3/GFAP及caspase-3/NeuN抗体双重标记法免疫荧光染色，观察脊髓的组织病理学改变。并且，对采用Western Blotting及免疫荧光测定GAP-43的表达水平。结果：大鼠坐骨神经结扎后，右足热痛阈明显降低（P0.05），结扎侧脊髓caspase-3的蛋白及mRNA的表达明显增高，TUNEL法显示脊髓背角凋亡的细胞明显增加，双重标记法免疫荧光显示凋亡的细胞为神经元而不是星型胶质细胞。caspase-3抑制剂及小RNA注射后，caspase-3蛋白及mRNA表达明显降低，凋亡神经元减少，大鼠热痛阈明显增高（P0.05），停止注射后，大鼠热痛阈降低。大鼠坐骨神经结扎后，GAP-43大量表达，而在未结扎侧的脊髓背角的表达则相对较少。Western blotting结果显示，在siRNA组及DEVD组，GAP-43的表达都明显低于NS组，说明通过抑制caspase-3凋亡通路可抑制GAP-43的高表达。结论：坐骨神经结扎引起的神经病理性疼痛可能与caspase-3通路介导的神经元凋亡有关。神经元凋亡时或凋亡后，GAP-43上调，促进芽生形成可能参与神经病理性疼痛。caspase-3的小RNA或抑制剂将可能成为治疗神经病理性疼痛的潜在途径。 关键词：凋亡；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3；神经病理性疼痛；芽生；生长相关蛋白-43；RNA干扰 Caspase-3 apoptosis signal increasing GAP-43 expression involved in neuropathic pain Wu Fei-xiang, Miao Xue-rong, Sun Yu-ming, YU Wei-feng (Department of Anesthesiology, Eastern Hepatobiliary Hospital,Second Medical Military University, Shanghai 200438) Abstract: Background and Objective　Neuropathic pain is poor treated due to the unknown mechanism. It is a worldwide problem. Cells apoptosis appears after nerve injury. But is cells apoptosis involve in neuropathic pain? The cells type of apoptosis is neurons or astrocytes? Why dose pain signal remain after neurons apoptosis? In present study, we administrated caspase-3 siRNA and caspas