第十一章 基因操作幻灯片.ppt

Chapter11.Gene manipulation;1. 分子生物学相关技术;1.1、Gel Electrophoresis;;;琼脂糖凝胶电泳 ;Agarose gel electrophoresis ;凝胶染色 ;;聚丙稀酰胺凝胶电泳;分子量范围 适用的凝胶浓度/(%) 蛋 白 质 ?104 20-30 1~4×104 15-20 1-5×104~1×105 10-15 1×105 5-10 ?5×105 2-5 核酸(RNA) ?104 15–20 104~105 5-10 105~2×106 2-2.6 ;核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex) 。;;Blotting　印迹技术;Probe　探针技术 ;　Labeling nucleic acid;印迹技术的类别及应用 ;1.2.1 Southern blotting DNA印迹技术;DNA的制备;1.2.2 Northern blotting　RNA印迹技术;1.2.3　Western blotting蛋白质印迹技术;三种印迹技术的比较;;聚合酶链式反应; ;5?;Cycle 3;PCR的基本反应步骤;模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+ ;Template;PCR thermal cycler;PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析;5′ AGAACATGGTGCGCAGGTTCTTGGTGACCCTCCGGATTCGGCGCGCGTGCGGCCCGCCGCGAGTGAGGGTTTTCGTGGTTCACATCCCGCGGCTCACGGGGGAGTGGGCAGCGCCAGGGGCGCCCGCCGCTGTGGCCCTCGTGCTGATGCTACTGAGGAGCCAGCGTCTAGGGCAGCAGCCGCTTCCTAGAAGACCAGGTCATGATGATGGGCA 3′ 　　;DNA测序技术基础：;Maxam Gilbert chemical method Sanger’s enzymic method ;1.4.1 Maxam-Gilbert法(化学裂解法);4组特异的化学反应： ①G反应：硫酸二甲酯使G的N7甲基化，加热引起甲基化鸟嘌呤脱落，多核苷酸链可在该处断裂。 ②G+A反应：用甲酸使A和G嘌呤环上的N原子质子化，从而使其糖苷键便的不稳定，再用哌啶使键断裂。 ③T+C反应：用肼使T和C的嘧啶环断裂，再用哌啶除去碱基。 ④C反应：当有高盐存在时，只有C与肼反应，并被哌啶除去。 ; 化学降解G反应模式图 ; 化学裂解法的示意图;1.4.2 dideoxy chain termination双脱氧链末端终止法; ATP、dATP和ddATP的结构; ;双脱氧末端终止法原理; 末端终止部位;;;1.4.3 DNA??序自动化原理;;1.4.4　RNA sequencing;Sequence database sequence database online 美国生物工程信息中心（GenBank) 基因组序列数据库（GSDB:Genome sequence database) :80/gsdb 欧洲分子生物学研究所（EMBL ) http://www.ebi.ac.uk 日本DNA数据库（DDBJ:DNA data bank of Japan) http://www.nig.ac.jp sequence database software (DNA club、GCG、DNAman);2. DNA cloning;2.1 Conception;基因重组：不同的DNA分子间发生共价连接形成重组DNA 分子。;基因克隆的技术路线 目的基因 载体 ;;2.1.2 V