第六节 目的基因的分离幻灯片.pptVIP

第六节 目的基因的获得 （基因克隆）;定义：基因工程的主要目的是通过优良性状相关基因的重组，获得具有高度应用价值的新物质（品系），为此必须从现有生物群体中，根据需要分离出可用于克隆的相关基因，这样的基因通常称之为目的基因，目的基因主要是结构基因。 目的基因可以是完整的基因（包括转录启动子、基因编码区和转录终止子），也可以是基因的部分片断。;作为一个能转录和翻译的结构基因必须包括转 录启动子、基因编码区和转录终止子。 启动子：是DNA上RNA聚合酶识别、结合和 促进转录的一段核苷酸序列。 基因编码区：包括起译码ATG、开放阅读框和 休止码TAA(TAG、TGA). 终止子：是一个能提供转录停止信息的核苷酸 序列。;编码区：原核生物的基因多数以操作子形式存在，完成同类功能的多个基因聚集在一起，处于同一个启??子的调控之下，下游同具一个终止子。原核生物基因在起译码ATG上游约10bp处，有一个富含嘌呤核苷酸的SD保守序列区，一般为AGGA,由此区转录的序列是翻译时核糖体识别、结合mRNA的位置，核糖体由此位置向前移动，寻找起译码AUG. 启动子：原核生物的启动子含－35序列保守区5‘TTGACA3’提供RNA聚合酶识别的信号；－10序列保守区5‘TATAAT3’，DNA双链从此解开双链转录。操纵子除了启动子以外，还有一些调控转录的其他因子，如调节因子和操纵因子等. 终止子：原核生物基因转录终止之前有一段回文序列结构，使RNA聚合酶减缓移动或停止RNA的合成。 ;基因编码区：真核生物染色体基因组的基因是单独存在的，并且两个基因之间有很长的间隔序列区（内含子）； 启动子：真核生物结构基因的启动子通常包含3个保守序列区：在－20至－30序列区有一个TATA框，DNA双链在此处开始解开；在－75序列区有一个CAAT框，其作用是与RNA聚合酶结合有关；在更上游处有一个GC框，是某些转录调控因子结合的序列； 终止子：高等真核生物结构基因休止码序列下游有一保守的AATAAA序列提供转录产物的释放信号； 真核生物染色图基因组的结构基因不具有SD序列区，核糖体与转录的mRNA的结合靠mRNA 5’端添加的“帽”结构 ；;质粒基因组 病毒（噬菌体）基因组 线粒体基因 叶绿体基因组;1. PCR技术获取目的基因;反转录PCR;已知目的基因序列的RT-PCR;已知目的基因蛋白产物的N端部分氨基酸序列信息时，就可以以此设计特异引物，RNA从中通过RT-PCR获得目的基因。首先Oligo(dT)12-18反转录第一链，接着以N端部分氨基酸序列反推的简并引物为正向引物，Oligo(dT)12-18为反向引物进行扩增。;依据部分序列信息获得基因全长序列;反向PCR;盒式PCR;RACE技术 ;2. 筛选基因文库获取目的基因;基因文库的概念 所谓基因文库,通俗地讲就是通过克隆的方法将某一基因组所有DNA或mRNA，利用适当的载体保存于适当宿主菌或噬菌体中形成的转化子群,所有重组DNA序列总和代表基因组的DNA全序列；基因文库包括基因组文库(genomic library)和cDNA文库(cDNA bank)； 构建基因文库的目的不仅仅是将生物的遗传信息以稳定的克隆形式存储起来，更为重要的是还能成为分离目地基因的主要途径和基础； 基因文库的容量 ：物种的基因组越大，目的基因在基因组中的拷贝数越少；克隆载体容量越小，所需克隆的数目就越多；目的基因在基因组中的拷贝数越多，越容易筛选到该基因。;基因组文库的构建过程 ;cDNA文库的构建;总的提取RNA 分离纯化mRNA 逆转录合成双链的克隆cDNA cDNA克隆;Two Libraries： cDNA Library vs Genomic Library;筛选基因文库获取目的基因;三. 图位克隆获得目的基因 ;染色体步移;染色体登陆 ;四. mRNA差别显示技术获得差异 表达的基因 ;绝大多数真核生物mRNA具有poly(A)尾，用Oligo(dT)12MN（共12种(4种M×3种N)）逆转录锚定引物，可以将所有的mRNA逆转录成为大致相等但结构不同的12份cDNA亚库,这个过程叫做差异显示逆转录即DDRT。 PCR所用的5’端引物为10 mer的随机引物,选择不同种的5’端随机引物可只扩增总cDNA中的部分cDNA链。通常采用12种反转录锚定引物和20种5’端随机引物进行240组PCR扩增,可以得到20 000条左右的DNA条带,每一条都代表一种特定的mRNA,基本重盖了总mRNA的96%。 扩增产物经过变性的聚丙烯酷肢凝胶电泳可以显示50～100条长度在l00～500bp之间的条带。如果将对照和诱导同时进行DDRT-PCR,电泳结果在同一位置的条带的