色谱分析在药物分析中的运用-国家海洋局第三海洋研究所科学仪器共享.ppt

色谱分析在药物分析中的运用 2005年1月 一、概述 色谱学已发展成为一个独立的学科 医药领域是色谱应用的重要领域之一 液相色谱目前在常规分析仪器中的排列 色谱学已发展成为一个独立的学科 色谱作为分离分析学科，已有近一个世纪的发展过程。进入20世纪以来，科学技术有了飞速发展，色谱学已发展成为一个独立学科，形成了薄层色谱、气相色谱、液相色谱、离子色谱、超临界流体色谱、亲合色谱、疏水色谱、毛细管电泳和电色谱等许多分支。 各种色谱仪与质谱，红外核磁等技术联用仪器已成为令人瞩目的高新技术产品。 医药领域是色谱应用的重要领域之一 在药物分析中，利用色谱分析方法显得更为重要，尤其是高效液相色谱法（HPLC）是目前药物分析中最常用的分析手段。它主要用于复杂成分、混合物的分离，即可用来作药物的定性、定量及杂质检查。 由于高效液相色谱法分析样品的范围不受沸点、热稳定性、相对分子质量大小及有机物与无机物的限制，使其应用范围极广。 一般说来，只要能将样品制成溶液，就可分析。且分离速度快，灵敏度高，色谱柱可反复使用，可选择的流动相比气相色谱法多。流出组分不被破坏，且容易收集，可在室温下操作，绝大部分药物均可用高效液相色谱法来作。 液相色谱目前在常规分析仪器中的排列 在2000年版一、二部药典中，用高效液相色谱法测定的品种比1995年版药典成倍地增加，2005年版一、二部药典又增加几倍。而高效液相色谱法在几种仪器分析方法中，其分析数量的排列为第二，因其分离效率高，又能准确地反映所测成分的真实含量。中国药典应用高效液相色谱法的情况，目前仅次于美国药典，而优于英国药典和日本药局方。 二、共同探讨高效液相色谱在实际操作中的部分问题 高效液相色谱方法的建立 色谱分离类型的选择 溶剂的选择 溶剂纯化 溶剂的脱气 样品溶剂的选择 检测器的选择 系统适应性试验 无参比标准的纯度评价 HPLC在药物分析中的应用范围 高效液相色谱方法的建立 应用HPLC对样品进行分离、分析，主要根据样品的性质，选择合适的分离类型及所用的色谱柱和流动相、检测器等。 （一）样品的性质 样品中待测组分的分子量大小、化学结构、溶解性等化学、物理性质决定着色谱分离类型的选择。 色谱分离类型的选择 高效液相色谱的各种方法有其各自的特点和应用范围，应根据分离分析的目的，样品的性质和含量、现有的设备条件等选择合适的方法。通常分离类型应根据样品的性质（如相对分子质量的大小，化学结构，溶解性及极性等）来选择，并根据此条件选择色谱柱和流动相。 溶剂的选择 在高效液相色谱分析中，流动相的种类、配比，对色谱分离效果影响很大，可供选择的固定相填料种类较少。因此，流动相的选择显得自关重要。 （1）溶剂纯度要高 （2）不能引起柱效损失或保留特性变化 （3）常用固定相与流动相的选择 （4）溶剂系统的选择常用 （5）缓冲系统及缓冲溶液的处理 溶剂纯化 在HPLC分离测定中，溶剂的纯度是很关键的。溶剂足够纯才不至于产生问题，对溶剂纯度的要求依应用情况而定。 溶剂的脱气 液相色谱仪的检测器常被溶剂中的气泡干扰，气泡的形成是由于被空气饱和的溶剂从高压流向低压，如柱出口，这些气泡形成干扰检测器光学道路的折射表面。因此，限制气泡和伴随的噪音的常用办法是在用前从溶剂中除去气泡。常用的脱气方法有真空泵脱气法和煮沸脱气法。 1．真空泵脱气 2．煮沸脱气法 3．溶剂的滤过 样品溶剂的选择 样品的溶剂应对样品溶解性大，且对样品稳定并与检测器相匹配，最好与流动相相同，这样可允许大量的进样量，但待测物的洗脱不应受影响，当样品溶剂与流动相不同时，则会出现样品溶剂的峰。 缓冲溶剂的注意事项 色谱柱使用的流动相pH值范围为2.5～7.5为宜。酸性太强会使键合的烷基脱落，碱性太强会使硅胶溶解，通常用缓冲液维持一定的pH值。缓冲液浓度范围为0.005～0.5mol/L，尽量用稀溶液为好，在用水和有机溶剂系统中，应注意盐的存在会改变溶剂的可混合性，在色谱分离过程中，绝不能发生相的分离和盐的沉淀。在HPLC中，最常用的缓冲溶液是醋酸盐和磷酸盐缓冲液。 检测器的选择 HPLC检测中，当样品有紫外吸收时，常选用紫外检测器，在药物分析文献中，用紫外检测器的占95%以上，使用时要注意溶剂的使用波长，即溶剂的极限波长必须低于检测波长。若使用荧光检测器或电化学检测器，可使灵敏度提高2～3个数量级，但不是所有化合物都有荧光，无荧光的物质可经衍生化作用形成荧光的化合物。电化学检测适用于有氧化还原性的药物。 系统适应性试验 当选用HPLC方法后，不同操作者各实验室之间实验数据的重现性应引起注意。在HPLC中，很难实现很好的重现性，因有许多具有相同名称的填料，由于生产厂家不同，性质也不尽相同。有许多HPLC填料或柱随着使用而变坏，其原因是填料的水解或