细胞工程实验第一部分植物组织培养实验讲稿.docVIP

实验一 MS培养基母液的制备、MS培养基的配制与灭菌 一、实验目的 1、学习和掌握MS培养基母液的配制原理 2、学习和掌握MS培养基的配制和灭菌方法。 二、实验材料 器材：电子分析天平、台秤、高压灭菌锅、PH酸度计、高压灭菌锅、量筒 、烧杯、三角瓶、药勺、玻璃棒 药品：NH4NO3、KNO3、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、KH2PO4、KI、 H3BO3、 MnSO4·4H2O、 ZnSO4·7H2O、 Na2MoO4·2H2O、CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O、FeSO4·7H2O、Na2-EDTA·2H2O、肌醇、烟酸、盐酸吡哆醇(维生素B6)、盐酸硫胺素(维生素B1)、甘氨酸、1 mol/L NaOH溶液、1 mol/L HCl溶液、琼脂、水解酪蛋白（CH） 三、实验原理 在配制培养基前，为了使用方便和用量准确，常常将大量元素、微量元素、铁盐、有机物质、激素类分别配制成比培养基配方需要量大若干倍的母液。当配制培养基时，只需要按预先计算好的量吸取母液即可。 对植物外植体进行离体培养时，要依靠培养基提供生长所需的营养成分。不同材料对培养基的要求不同，适当的设计和选用培养基，对植物组织培养取得成功至关重要的。 四、实验步骤 （一）为什么要配制母液？ 1）、方便 2）、准确（有些成分量太小） 3）、母液要分类配，否则有些成分混合一起会产生沉淀 （二）MS培养基母液的配制： 1、大量元素母液的配制 各成分按照表1培养基浓度含量扩大20倍，用天平称取，用蒸馏水分别溶解，按顺序逐步混合。后用蒸馏水定容到1000ml的瓶中，即为20倍的大量元素母液。贴好标签保存于冰箱中。 配制培养基时，每配1L培养基取此100ml。 表1 MS培养基大量元素母液制备 序号 药品名称 培养基配方 浓度（mg/L） 扩大20称量(mg) 配体 积量 储存方式 1 NH4NO3 1650 33000 250 4℃保存 2 KNO3 1900 38000 3 CaCl2·2H2O 440 8800 4 MgSO4·7H2O 370 7400 5 KH2PO4 170 3400 注意： (1) 配制大量元素母液时，各种化学药品必须先以少量重蒸馏水使其充分溶解后才能混合，混合时应注意先后顺序。特别应将Ca2+、SO42一、Mg 2十和H2PO4一等离子错开混合，速度宜慢，边搅拌边混合。 (2)CaCl2·2H2O要在最后单独加入，在溶解CaCl2·2H2O时，蒸馏水需加热沸腾，除去水中的CO2，以防沉淀。另外，CaCl2·2H2O放入沸水中易沸腾，操作时要防止其溢出。 ２、微量元素母液的配制 MS培养基的微量元素无机盐由7种化合物（除Fe ）组成。微量元素用量较少，按照表2配方，用电光分析天平称量，其它同大量元素。 配制培养基时，每配制1L培养基，取微量10ml? 表2 MS培养基微量的配制 序号 化合物名称 培养基浓度（mg/L） 扩大100 称量(mg) 配制 体积（ml） 药品 用量 (g) 储存 方式 1 MnSO4·4H2O 22.3 2230 100 避光 4℃保存 2 ZnSO4·7H2O 8.6 860 3 H3BO3 6.2 620 4 KI 0.83 83 5 Na2MoO4·2H2O 025 25 6 CuSO4·5H2O 0.025 2.5 7 CoCl2·6H2O 0.025 2.5 3、铁盐母液的配制 目前常用的铁盐是硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠的螯合物，必须单独配成母液。这种螯合物使用起来方便，又比较稳定，不易发生沉淀。配制方法同上，直接用蒸馏水加热搅拌溶解。 配制培养基时，配制1L取此液10ml 表3 MS铁盐母液的配制 序号 化合物名称 培养基浓度（mg/L） 扩大200倍称量 (mg) 配制 体积（ml） 药品 用量(g) 储存 方式 1 Na2-EDTA 37.3 7460 100 避光 4℃保存 2 FeSO4·7H2O 27.8 5560 注意： 在配制铁盐时，如果加热搅拌时间过短，会造成FeS04和Na2EDTA鳌合不彻底，此时若将其冷藏，FeS04会结晶析出。为避免此现象发生，配制铁盐母液时， FeS04和Na2EDTA应分别加热溶解后混合，并置于加热搅拌器上不断搅拌至溶液呈金黄色(约加热20 - 30 min)，调pH值至5 .5，室温放置冷却后，再冷藏。 4、有机母液的配制 MS培养基的有机成分有甘氨酸、肌醇、烟酸、盐酸硫胺素和盐酸吡哆素。培养基中的有机成分原则上应分别单独配制。配制直接用蒸馏水溶解，注意称量时用电子分析天平。