植物总RNA的提取精讲.pptVIP

实验 十 植物总RNA的提取;RNA的制备与分析对于了解基因在转录水平上的表达与调控和cDNA的合成都是必须的，RNA的纯度和完整性对于Northern blot，RT-PCR和cDNA文库的构建等分子生物学实验都至关重要。RNA分离的方法很多，其中最关键的因素是尽量减少RNA酶的污染 异硫氰酸胍法、SDS-酚法、CTAB法及试剂盒提取法 人的汗液，呼吸气体，唾液等都含有大量的RNase；植物组织细胞本身内部也含有大量RNase RNase变性剂常用的有DEPC、氧钒核糖核苷复合物等 RNase抑制剂有：RNase inhibitor、亚精胺、尿素、巯基乙醇等;一、实验目的： 了解真核生物基因组RNA提取的一般原理。 通过RNA电泳带评价RNA质量 。;二、一般原理 CTAB裂解植物细胞 LiCl沉淀总RNA 亚精胺和β-巯基乙醇等抑制RNA酶。 酚/氯仿/异戊醇除去蛋白质 ;三、材料 植物组织：植物叶片 四、设备  移液器，冷冻高速离心机，低温冰箱，台式高速离心机，液氮罐，陶瓷研钵，1.5ml离心管。 ;提取液成分: 20g/L CTAB , 20g/L PVP , 50mmol/L EDTA，4.0mol/ L NaCl，100mmol/L Tris-HCl -----每组200 ml（用0.1%的DEPC水配制），分装3~4瓶灭菌。 10mol/L LiCl （用0.1%的DEPC水配制），分装3~4瓶灭菌 无RNA酶灭菌水：用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃ 2小时）装蒸馏水，然后加入0.1%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌 20 ml*5 75%乙醇：用DEPC处理水配制75%乙醇，（用高温灭菌器皿配制，每组200 ml ，分装3~4瓶），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。 氯仿:异戊醇 (24 : 1 by volume) 或氯仿. 200 ml，分装3~4瓶 异丙醇、无水乙醇、70％乙醇 巯基乙醇、亚精胺（100mol/L） 10 ml;六、操作步骤;取上清于另一支1.5 mL离心管中加入1/4体积的10 mol/L LiCl混匀在-20℃下沉淀过夜。 12000 r/min，4 ℃离心20 min，弃去上清液，晾干后加100 μL 0.1% DEPC水溶解沉淀后，转入到另一支1.5 mL的离心管中。 再加入等体积的氯仿-异戊醇（24：1，v/v），12000r/min，4℃离心10min，然后用移液枪小心吸取上清液，于另一支1.5mL离心管中，加入2倍体积的无水乙醇沉淀RNA，-20℃，2 h。 12000r/min，4 ℃，20 min，弃去上清液，用现配的75%乙醇洗涤沉淀，加入40 μL 0.1%DEPC灭菌水溶解沉淀，-70 ℃保存。 使用0.1% DEPC配置1%的琼脂躺凝胶进行电泳。;利用 CTAB 法提取的叶总 RNA ,其28S和18S两条带带型清晰 ,且 28S rRNA在亮度上均为18S rRNA的2倍，两条带之间无弥散现象 ,说明 RNA在提取过程中结构完整 ,基本排除了 RNase 的污染 ，未发生明显降解 2. 将用改良的CTAB法提取的RNA，取20μLRNA溶液加入1980 μL 0.1%的DEPC灭菌水稀释100倍，紫外可见分光光度计（UV2102， UNICO）分别检测所得到的各组织RNA在波长为230nm，260nm，280nm的光吸收值，每个波长重复3次，分别计算A260/A280 和A260/A230取平均值。;七、RNA质量检测;;;RNA酶的变性或失活剂有那些？其中在总RNA的抽提中主要可用哪几种？ 如何克服RNA提取过程中的降解？ 如何检测提取的总RNA的质量和纯度？