实验一 鸡蛋清中卵白蛋白和卵球蛋白分离与纯化.docVIP

实验一 鸡蛋清中卵白蛋白和卵球蛋白分离与纯化 一、实验目的 　　　了解盐析分级分离蛋白质的基本原理及操作. 　　　了解葡聚糖凝胶SephadexG-25分离蛋白质的基本原理和凝胶柱的制备及洗脱技术. 实验原理 据研究结果分析每百克鸡蛋含蛋白质12.8克，主要为卵白蛋白和卵球蛋白，还含有少量的卵粘蛋白、卵转铁蛋白、类卵粘蛋白、溶菌酶等，其中含有人体必需的8种氨基酸。本次实验利用盐析法和柱层析法分离和纯化卵白蛋白和卵球蛋白。 　　盐析的原理：蛋白质是亲水胶体，在高浓度的中性盐影响下脱去水化层，同时，蛋白质分子所带的电荷被中和，结果蛋白质胶体的稳定性遭到破坏而沉淀析出。盐析不同的蛋白质所需中性盐浓度与蛋白质的种类及pH有关。分子量大的蛋白质(球蛋白)比分子量小(白蛋白)易析出。改变盐浓度，使不同分子量的蛋白质分别析出。 　　脱盐的原理：含盐蛋白质溶液流经凝胶层析柱时，小分子量的盐分子因进入凝胶的筛孔中，向下移动的速度较慢；而大分子的蛋白质不能进入凝胶的筛孔，以较快的速度流过凝胶柱，从而使蛋白质与盐分开。G-25:1000---5000；G-50:1500---30000；G-75:3000---80000 三、实验用品 仪器：752型紫外可见分光光度计、离心机、层析装置 器皿：5ml试管20支、50ml烧杯2个、试管架、玻棒、石英比色皿、玻璃层析柱 药品及材料：新鲜蛋清、固体硫酸铵、饱和硫酸铵溶液、凝胶SephadexG-25 饱和硫酸铵溶液：称固体硫酸铵(分析纯)850g，置于1000ml蒸馏水中，在70-80℃水温中搅拌溶解。将酸度调节至pH7.2，室温中放置过夜，瓶底析出白色结晶，上清液即为饱和硫酸铵溶液。 四、实验步骤 1、卵清蛋白与卵球蛋白的分离 取卵清2mL于试管中；加2mL的半饱和硫酸铵溶液，搅拌均匀，静置2分钟；3000r/min,离心5分钟；沉淀为卵球蛋白(M130000)，加蒸馏水定容至4mL溶液。 取上清液，加入固体硫酸铵（计算4mL溶液饱和度由50%变化为100%需要加入硫酸铵的克数1.57g）；3000r/min，离心5分钟；沉淀为卵清白蛋白(M43000)，加蒸馏水定容至4mL溶液。 2、 凝胶柱层析（重点讲解，不安排做试验） (1) 凝胶柱的准备：sephadexG-25沸水溶胀30分钟，倾泻法倾去悬浮的小颗粒，湿装法装柱?? (2) 加样和洗脱：先将柱内液体用滴管轻轻吸去，使液面下降到刚与凝胶表面相切，用枪吸取1mL样液沿着管壁加入柱子上方，再加3mL蒸馏水，开始脱盐，每管收集2mL共15管。 (3)收集和测定：280nm紫外吸收测定蛋白质 含量或者用考马斯亮蓝法在在595nm波长测吸光度值。 (4)以洗脱体积为横坐标，吸光值为纵坐标,绘制洗脱曲线，将蛋白质溶液收集待用。 将每管的洗脱液取出1ml，加入几滴BaCl2溶液，观察是否有沉淀，以此判断脱盐是否完全。 数据结果与分析 （1）数据记录与分析 鸡蛋清蛋白称量项数据记录与分析卵球蛋白离心管质量/g 卵球蛋白与离心管质量/g 卵球蛋白质量/g 卵清白蛋白离心管质量/g 卵清白蛋白与离心管质量/g 卵清白蛋白质量/g  （2）绘制洗脱曲线 0612182430364248546000.0110.7670.4680.2430.040.0570.0240.0690.0170.053