富组蛋白1促进人表皮细胞_人成纤维细胞增殖和迁移在创伤愈合中的作用及机制研究555_.kdh.pdfVIP

第三军医大学博士学位论文 第三部分 EGFR，TGF ?RⅡ，Syndencan-1及Syndencan-4在Hst1 诱导HaCaT细胞、HF增殖、迁移过程中的作用研究 前两部分实验从现象上证实Hst1对人表皮细胞，人成纤维细胞增殖或迁移具有活化 作用，但机制尚不明了。本部分实验仍从现象学角度，试图探讨Hst1对两种细胞作用的 可能机制，为下一步研究奠定基础。实验结果显示四种细胞表面受体（EGFR、TGF ?RⅡ、 Syndecan-1、Syndecan-4）抗体均能抑制Hst1诱导的HaCaT细胞增殖和迁移功能， Syndecan-4抗体能够显著抑制Hst1诱导的HF增殖功能。 实验材料 1. EGFR(N-20)抗体：美国Santa公司。 2. TGF ?RⅡ（T-20）抗体：美国Santa公司。 3. Syndecan-1(N-18)抗体：美国Santa公司。 4. Syndecan-4(N-19)抗体：美国Santa公司。 其余同第一、第二部分。 实验方法 一、人表皮HaCaT细胞、人成纤维细胞的培养： 同第一、第二部分。 二、EGFR，TGF?RⅡ，Syndencan-1及Syndencan-4抗体对Hst1诱导HaCaT细胞、HF 增殖功能的影响 MTT法检测细胞增殖状况。按实验要求设调零组、对照组及实验组共7组（A组： 30 μg /mL Hst1组；B组：30 μg /mL Hst1 +EGFR(N-20)P组；C组：30 μg /mL Hst1 +TGF ?RⅡ（T-20）P；D组：30 μg /mL Hst1 +Syndecan-1(N-18)组；E组：30 μg /mL Hst1 + Syndecan- 4(N-19)组），每组设复孔6孔。 1. 取对数生长期细胞，以5×103个/mL密度接种于96孔细胞培养板； 2. 细胞培养液过夜培养，待细胞完全贴壁生长； 3. 浓度1%NBS的培养基常规过夜培养； 51 第三军医大学博士学位论文 4. 实验组按分组配制并加入30 μg/mL Hst1及不同抗体的浓度1%NBS的培养基100 μL，抗体浓度2.5 μL/mL。对照组为含细胞无药物的浓度1%NBS的培养基100 μL，调零 组孔内为无细胞及药物的浓度1%NBS的培养基100 μL； 5. 常规方法培养； 6. 于24 h、48 h、72 h点定时取样，每组各取6孔，进行MTT实验，实验步骤同第一 部分。 三、EGFR，TGF ?RⅡ，Syndencan-1及Syndencan-4抗体对Hst1诱导的HaCaT细胞迁 移功能的影响 采用体外细胞划痕法。按实验要求设MMC处理组及无MMC处理组两大组，各组各 设对照组及实验组共6组（Ⅰ组：30 μg/mLHst1、Ⅱ组：30 μg/mL Hst1 +EGFR(N-20)P组； Ⅲ组：30 μg/mL Hst1 +TGF ?RⅡ（T-20）P；Ⅳ组：30 μg/mL Hst1 +Syndecan-1(N-18)组； Ⅴ组：30 μg/mL Hst1 + Syndecan-4(N-19)组）。每组设复孔2孔。 1. 24孔细胞培养板底部中央做十字形标记； 2. 按常规方法等量接种HaCaT细胞于培养板内，常规方法培养； 3. 细胞单层融合时，按分组取MMC处理后，浓度1%NBS的1640培养基过夜培养； 4. 无菌200 μL移液器枪头在细胞层垂直划痕，建立体外细胞创伤模型，方法同第一 部分； 5. 实验组按要求配制并加入含Hst1及抗体的浓度1%NBS的1640培养基200 μL，抗 体浓度2.5 μL/mL。对照组加等体