双缩脲法测定蛋白质含量选编.ppt

实验 双缩脲法测定蛋白质浓度;一、实验目的 1.学习分光光度法测定的原理和方法 2.学习蛋白质含量测定的原理和方法 3. 掌握双缩脲法测定蛋白质含量的方法 ;二、原理;2．主要方法： （1）比较吸收光谱曲线 （2）比较最大吸收波长 蛋白质的最大吸收波长为280nm， 核酸的最大吸收波长为260nm。 ;（3）比较吸光度的比值 纯DNA;（二）利用吸收光谱对物质进行定量分析; 1．原理 Beer-Lambert（比尔）定律： T=I/I0 A=lg1/T=lgI0/I A=KCL 其中：T为透光率；A为吸光率；I0为入射光强度；I为透射光强度； K为吸收系数；C为溶液浓度；L为溶液光程的厚度 ; 2．常用方法 （1）标准曲线法 　　　　　　　　　　　　　　　　　 标准曲线与样品的测定条件必须一致。;（2）标准管法 CX/AX=CS/AS，已知CS，测定AS、AX，可求得CX。 （3）摩尔吸光系数法 C=A/?（?为L=1cm，C为1 mol/L时的吸光系数，也称为摩尔吸光系数。;四、分光光度计的使用; 1．722型分光光度计的外形;2.仪器操作键介绍 “方式设定”键（MODE）：用于设置测试方式 “100%T/0ABS”键：用于自动调整100.0%T(100.0透射比)或0ABS(零吸光度) “0%T”键：用于自动调整零透射比 “波长设置”旋钮：用于设置分析波长 ;3.样品测试操作 ① 打开电源开关，使仪器预热20分钟 ② 用“波长设置”按钮将波长设置在您将要使用的分析波长位置上 ③ 打开样品室盖，将挡光体插入比色皿架，并将其推或拉入光路 ④ 盖好样品室盖，按“0%T”键调透射比零 ⑤ 取出挡光体，盖好样品室盖，按“100%T”调100%透射比 ⑥ 按“方式键”（MODE）将测试方式设置为吸光度方式(A) ⑦ 将参比溶液和被测溶液分别倒入比色皿中 ⑧ 打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿分别插入比色皿槽中，盖上样品室盖 ⑨ 将参比溶液推入或拉入光路中，按“100%T”调零A ⑩ 将被测溶液拉入光路中，此时，显示器上所显示是被测样品的吸光度参数 实验完成后，关闭电源，洗净比色皿，并盖好盖布。;;;;微量凯氏定氮法测定蛋白质总含量;Folin-酚试剂法(Lowry法)测定蛋白质浓度 ;紫外分光光度法测定蛋白质浓度 ;总蛋???定量分析－BCA（Bicinchoninic acid，二辛可宁酸、二羧基二喹啉）;?基本原理： 碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+， Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。;考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度 ;Coomassie Dye-Based 蛋白质定量;（二）双缩脲法测定蛋白质 H2N-CO-NH2 + NH2-CO-NH2 H2N-CO-NH-CO-NH2 ＋NH3 双缩脲 双缩脲反应：双缩脲在碱性条件下与铜离子结合生成紫红色化合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比。 本法测定蛋白质范围1-10mg ;三、操作步骤 1.取15支试管，按下表编号、加试剂;四、结果处理 1.绘制标准曲线 以牛血清白蛋白含量为横坐标，OD540为纵坐标，绘制标准曲线。 2.样品的计算 根据样品的OD540从标准曲线上查得样品的蛋白质含量（mg），再根据样品的体积计算出样品的浓度。 五、注意事项 1.须于显色后30min内测定，且各管由显色到比色时间应尽可能一致。 2.*样品蛋白质含量应在标准曲线范围内。 3.比色杯的使用