第05章节细胞培养dun.ppt

第五章 细胞培养 ;细胞培养技术也叫细胞克隆技术。不论对于整个生物工程技术，还是其中之一的生物克隆技术来说，细胞培养都是一个必不可少的过程，细胞培养本身就是细胞的大规模克隆。细胞培养，既包括微生物细胞的培养，细胞培养技术可以由一个细胞经过大量培养成为简单的单细胞或极少分化的多细胞，这是克隆技术必不可少的环节，而且细胞培养本身就是细胞的克隆。通过细胞培养得到大量的细胞或其代谢产物。因为生物产品都是从细胞得来，所以可以说细胞培养技术是生物技术中最核心、最基础的技术。;消化初代培养法如左图。 对于悬浮生长的细胞，如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无需消化，可采用低速离心分离，直接培养，或经淋巴细胞分层液分离后接种培养。;5.1 原代细胞的培养与维持 原代细胞（primary culture cell）是指从机体取出后立即培养的细胞。有人把培养的第1代细胞与传10代以内的细胞统称为原代细胞培养。 ;①静置贴壁细胞(包括半贴壁细胞)的培养的起始的2天中尽量减少振荡，以防止刚贴壁的细胞发生脱落，漂浮。 ②若原代贴壁细胞不是用于长期培养，只是用于分离繁殖或测定病毒之用，其细胞浓度可以加大，尽量贴成厚层以利病毒的效价提高和测定结果（如空斑）更加明显、准确。 ;③待细胞基本贴壁伸展并逐渐形成网状，此时的pH若有明显变化，应将原代细胞换液，即倒去旧液，换入与原培养液相同的等量新鲜的培养基，以便除去衰老、死亡的细胞和陈旧的培养基，使贴壁细胞能获得充足的营养。 ④若希望细胞能在较长时间内能维持存活，但不需增殖，此时要换成含血清低的维持液。;⑤悬浮细胞：凡来自外周血、胸腹水、脾脏、淋巴结、骨髓的淋巴细胞、造血干细胞以及白血病细胞等悬浮细胞，在原代培养时要尽量去除红细胞。 待细胞开始增殖甚至结成小团块，培养基中pH变酸，说明细胞生长繁殖良好。 一般每隔3天需半量换液一次（换液时尽量使细胞不丢失）。 待细胞增殖加快，浓度明显增加，pH发生明显变化时，此时可考虑传代。传代一定要待细胞密度较高时才能进行，以防传代失败。;5.2 原代细胞培养的传代（Subculture） 原代培养后由于细胞增殖，数量增加甚至达饱和密度，贴壁细胞的相互汇合，使整个瓶底逐渐被细胞覆盖，细胞难以继续生长繁殖，需要进行分瓶培养，即传代。 每进行一次分离再培养称之为传一代，传至5～10代以内的细胞通常称为次代培养细胞，传至10~20代以上的细胞，通常确定为传代细胞（或称传代细胞系）。 传代细胞系的建立的关键是初代培养的首次传代。;原代细胞经传代后所形成的传代细胞，可根据不同细胞采取不同的方法进行传代。 贴壁生长的细胞用消化法传代， 部分贴壁的细胞用直接吹打或用硅胶软刮的刮除法传代。 悬浮细胞可采用加入等量新鲜培养基后直接吹打分散进行传代，或用自然沉降法加入新培养基后再吹打分散进行传代。 随后细胞系的维持是通过换液传代再换液、再传代和细胞种子冻存来实现的。;传代时注意事项： (1)细胞生长密度不高时，或未能达到覆盖整个瓶底时不能急于传代； (2)原代培养的贴壁细胞多混杂细胞，形态各异，用胰蛋白酶消化时要掌握好消化时间； (3)吹打已消化的细胞要轻巧，既不能听到有明显的吹打声，又不能有大量泡沫在悬液中形成，以尽可能减少对细胞的机械损伤； (4)首次传代时细胞接种数量要多一些，以利于细胞的生存和繁殖，如果消化分离的细胞悬液有组织块，也一并传入到培养瓶，尽量减少细胞损失； (5)首次传代培养时的pH不能高，宁可偏低一些。此外，小牛血清浓度可适当加大。;5.3 细胞的纯化 一般分为两种：自然纯化和人工纯化。 （1）自然纯化 利用某一种类细胞的增殖优势，在长期传代过程中靠自然淘汰法，不断排挤其他生长慢的细胞，靠自然增殖的潜力，最后留下生长优势旺的细胞，达到细胞纯化的目的。 这种方法常无法按照需要和实验要求及目的来选择细胞，花费时间长，留下来的往往是成纤维细胞。恶性变异的肿瘤细胞或突变的细胞可以通过此方法而保留下来，不断纯化而建立细胞系。;（2）人工纯化 利用人为手段造成某一细胞生长有利的环境条件，抑制其他细胞的生长从而纯化细胞。 ①细胞因子依赖纯化法指人和动物组织中某些细胞需要有特殊的细胞因子存在的微环境才能长期存活和生长繁殖，如：IL-2是T细胞生长所必需的细胞因子，BCGF是B细胞的生长因子。 ②酶消化法是比较常用的纯化方法，对于贴壁细胞，能利用上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶的耐受性不同，使两者分开，达到纯化的目的。 酶消化法对贴壁细胞与半贴壁及粘附细胞间的分离纯化也是十分有效的。;例：骨髓基质肌样细胞的纯化 在血液细胞和骨髓细胞静置培养时，常有许多肌样细胞和骨髓基质细胞贴壁生长，但也有许多淋巴细胞、单核细胞、粒细胞粘附其上，种类混杂。 鉴于粘附细胞贴壁