组织取材、固定和常规HE染色.ppt

取材/固定/HE;组织标本取材; 组织标本的取材常受到各种因素的影响，如各种内窥镜钳取的组织，常因过度挤压而变形，严重者组织结构被破坏。大组织标本病变分布广泛，抗原在组织中分布不均一，常出现人为的组织取材不准确。为了避免上述缺点，组织取材时应注意： ;①取材用具必须锋利，以免组织受挤压； ②取材部位必须是主要病变区； ③必须取病灶与正常组织交界区； ④必要时取远距病灶区的正常组织作对照。 　　; 为充分保存组织的抗原性，标本离体后应立即处理，不能长时间暴露在空气中，组织切除后,如果不能及时固定或冻存,可以放入生理盐水或PBS中短时间保存。否则，立即速冻进行冰冻切片，或立即用固定液固定后进行脱水、透明、浸蜡、包埋制成石蜡组织块。如不能迅速制片，可贮存于液氮罐内或-70℃冰箱内备用。;为了避免组织形成冰晶，组织冻存前需要蔗糖处理，密封后冻存。 蔗糖处理液使用浓度为5%-30%。一般光镜研究，仅用20%蔗糖处理已足矣，若制备电镜标本，在冰冻前最好经上行蔗糖（5%、10%、15%、20%及20%蔗糖-5%甘油等）处理，以确保其良好的细微结构。 ; 标本刚放入蔗糖液时常浮在上面，当标本沉底后即可进行冷冻保存。通常光镜标本浸泡在20%蔗糖液中过夜。都能达到要求。组织冻存的主要目的是为研究作准备，组织学研究不一定都采用石蜡制片，凡是可以将组织制成蜡块的一般不采用冷冻保存。因为保存组织蜡块即方便又可靠，可以长期室温保存。; 为了防止挤压组织，一般不用剪刀取材，可以用手术刀片或剃须刀片，组织切面要平整。 较大的实质性器官需要切开固定，带包膜的组织要将包膜剖开固定，胃、肠、胆囊等应将内容物用生理盐水或PBS洗掉后固定，避免用刀刮除内容物，组织取材后避免水洗。; 一般取材后用10%福尔马林（10% NBF）固定。常规取材厚度 0.2-0.3cm，一般不超过0.5cm。组织块大小1.5cmⅹ1.5 cmⅹ0.2 -0.3cm，免疫组化和原位杂交1cm ⅹ1cm ⅹ0.2cm为宜。取材的组织要新鲜，固定要及时。;固定的作用;; 总之，固定剂能够保存细胞和组织形态。为组织和细胞的制备打基础。在细胞和组织研究过程中固定剂扮演着保护角色。固定剂通过凝固、生成添加化合物或两者结合，使蛋白质改变原有的性质。在蛋白质结构内发生构造改变，引起酶的失活。 根据研究的目的不同选用不同的固定剂，通过限定固定剂保存组织内原有的成分。; 不同的研究目的选择不同的固定剂。总是折衷地改变固定剂和固定方案，细胞学固定方案完全不同于组织学和电镜。 Giemsa、罗曼诺夫斯基染色法染色前需要空气干燥，干燥后选择一种高等级甲醇固定1-3 min。而巴士染色适合于湿固定。 空气干燥涂片的优点比湿固定好。能把细胞成分完整精确的保存于载玻片上。; 戊二醛常用于电镜标本的固定，戊二醛的固定速度很快，但渗透力差。总之，戊二醛对细胞浆和核的细微结构固定效果较好。标准固定液为2%戊二醛。选择固定液对于免疫细胞化学技术是十分重要，例如，保存抗原选用甲醇固定不理想。尤其是白细胞表面抗原，通常选用无水丙酮固定1-3min。; 甲醛基础固定剂用于细胞浆抗原和膜结合的免疫球蛋白固定比较稳定。福尔马林-丙酮混合应用用于淋巴细胞标记物的固定比较好。细胞涂片用95%乙醇固定或聚乙二醇-乙醇液喷雾固定对多数抗原的保存是满意的。乙醇不适合用于淋巴瘤标记物固定，例如，T和B细胞抗原。; 一种固定液单独使用往往很难适应多种组织和细胞成分的保存，而且容易产生较大的副作用。因此，在实际工作中，通常将几种固定剂按一定比例配制成复合固定液使用。复合固定液的种类很多，目前还没有一种标准的固定剂适用于各种组织和细胞成分及抗原成分的保存。因此在具体使用时，必须对各种固定剂的性能有所了解。; 根据组织大小确定固定时间，常规H.E染色固定梢长一点没有什么关系。如果做免疫组化固定时间不宜太长，短时间甲醛固定会造成部分组织抗原活性受到遮蔽。，1.0X1.0X0.3cm大小的组织，用10%缓冲福尔马林中固定6-24小时不会有影响。; 缓冲福尔马林固定组织的速度大约1-4小时/mm。比较大的标本应该延长固定时间。一般固定后及时进行组织脱水处理，如果不能及进行组织脱水处理。固定完成后可以将组织转移到70%乙醇中保存，推测这样做的目的可以解除甲醛对组织继续固定，有利于组织抗原成分的保存。另外，组织脱水通常从70%乙醇开始,70%乙醇即可以保存组织也不会影响组织制片。;固定剂种类; 醛类 包括甲醛（福尔马林）和戊二醛，经醛固定的组织在蛋白质内形成交联，在赖氨酸之间交联更明显。这种交联不会破坏蛋白质的整体结构。 免疫酶组织化学染色选用甲醛固定效果比较好。标准液是10%中性缓冲福尔马林（NBF）。缓