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第3章:(酶工程)动植物细胞培养产酶
;植物细胞结构; 植物、动物、微生物细胞的特性比较;三者之间的差异主要有:
植物细胞动物细胞微生物细胞。
动物细胞、植物细胞的生产周期比微生物长。
植物细胞和微生物细胞的营养要求较简单。
植物细胞的生长以及次级代谢物的生产要求一定的光照。
植物细胞和动物细胞对剪切力敏感。
植物、微生物和动物细胞的主要目的产物各不相同。;一、植物细胞培养产酶
从外植体中→选育植物细胞→高产稳定细胞→培养→各种产物
1.植物细胞培养的特点
提高产率和产品质量
缩短周期
易于管理
;2.培养基特点
①需要大量无机盐
②需多种维生素和激素
③氮源一般为无机氮
④一般以蔗糖为碳源
应用最广的是MS培养基和LS培养基
MS培养基是1962年为烟草细胞培养而设计的培养基。LS培养基是在其基础上演变而来的。P82表3-3;3.培养工艺:——悬浮细胞培养
⑴工艺流程
外植体→细胞的获取→细胞培养→分离→纯化产物
①外植体选择和处理
选取那些无病虫害、生长旺盛、生长规则植株,把茎、叶、根、芽,花、果实等切成小片段或小块。用70%-75%乙醇,0.1%升汞消毒,无菌水漂洗。;外植体:
从植株取出,经过预处理后,用于植物组织培养的植物组织(包括根、茎、叶、芽、花、果实、种子等)的片段或小块。
愈伤组织:
将上述外植体植入诱导培养基中,于25℃左右培养一段时间,从外植体的切口部位长出小细胞团。;水稻的外植体(幼胚)和愈伤组织;②植物细胞获取
直接分离法
愈伤组织诱导法
原生质体再生法
③细胞悬浮培养:转新培养基,在生物反应器中进行培养
④分离纯化:生化技术;⑵ 培养条件的影响与控制
①温度:室温25℃
②pH:微酸性范围。即pH 5.0-6.0
③通气与搅拌
④光照的控制:强度和时间有一定要求
⑤前体的添加(饲喂)
⑥刺激剂的应用;4.植物细胞培养产酶实例
以大蒜细胞培养生产超氧化物歧化酶(SOD)为例
(1)大蒜愈伤组织的诱导
选取结实、饱满、无病虫害的大蒜蒜瓣,去除外皮,先用70%乙醇消毒20s,再用0.1%升汞消毒10min,然后无菌水漂洗3次。
在无菌条件下,切成0.5cm3的小块,植入含有3mg/L 2,4-D和1.2mg/L 6-BA 的半固体MS培养基中,在25℃,600lux,12h/d光照条件下培养18d,诱导得到愈伤组织,每18天继代一次。;(2)大蒜悬浮细胞培养
将上述在半固体MS培养基上培养18d的愈伤组织,在无菌条件下转入含有3mg/L 2,4-D和 1.2mg/L 6-BA (苄基腺嘌呤) 的液体MS培养基中,加入灭菌的玻璃珠,25℃,600lux,12h/d光照条件下震荡培养18d,使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞。
然后在无菌条件下,经过筛网将小细胞团或单细胞转入含有3mg/L 2,4-D和1.2mg/L 6-BA 的液体MS培养基中,25℃,600lux,12h/d光照条件下震荡培养18d。;(3)酶的分离纯化
细胞培养完成后,收集细胞,经过细胞破碎、提取、分离得到超氧化物歧化酶。;二、动物细胞培养产酶 1.动物细胞培养的特点
动物细胞可以产生各种有效高价值的物质
需添加抗生素(常用青霉素和链霉素联合)
细胞生长速度慢
细胞体积大,无细胞壁保护,对剪切力敏感。
反应过程成本高,产品价格贵
细胞具有锚地依赖性。宜采用贴壁培养
原代细胞一般繁殖50代;2.培养方式
(1)悬浮培养
(2)贴壁培养
滚瓶培养
微载体培养(microcarrier culture)
(3)固定化细胞培养
包埋(entrapment)和中空纤维(microencapsulation)???养
;3.工艺控制
⑴工艺流程
种质细胞 (体细胞;杂交瘤细胞) 分散成悬浮细胞 细胞悬浮或贴壁培养 收集 分离纯化 产物
;⑵培养条件的影响与控制
①温度:一般控制在36.5℃.
②pH值:一般控制在7.0-7.6的微碱性范围内。
③渗透压: 应与细胞内渗透压相同。
④溶解氧:根据情况随时调节。
;4.产酶实例
以人黑色素瘤细胞培养生产组织纤溶酶原激活剂为例
纤溶酶原 纤溶酶
;①种质细胞用胰蛋白酶处理,分散,pH7.4磷酸盐洗涤。稀释成细胞悬浮液
②接种到反应器中,与37℃ CO2培养箱中,长成致密单层
③去培养液,用pH7.4磷酸盐冲洗细胞
④换无血清Eagle培养液,继续培养
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