第9章：基因敲除与药学.ppt

第九章：基因敲除与药学 ;基因敲除技术与诺贝尔奖;基因敲除简介;基因敲除（gene knock-out） 通常所说到的基因敲除，又称基因打靶，通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重 组，进行精确的定点修饰和基因改造，把具有功能的同源序列置换出来，造成功能基因的缺失或失活。 ;; 要有将外援基因导入宿主细胞的载体 2.能接受外援基因的受体（常用胚胎干细胞）;基因敲除载体 通常，我们将外源基因DNA片段通过相应载体导入ES细胞中，一个好的载体应具备以下特点： 能在宿主细胞中稳定存在 2.具有多个限制性内切酶的单一酶切位点，即 multiple cloning site(MCS),便于外源基因的插入。常用质粒。 ;3. 具有一个以上的遗传标志，便于对基因重组的ES细胞进行筛选。 常用的筛选标记为正负筛选：Neo（新霉素磷酸转移酶）基因阳性筛选标记和HSV-tk（单纯袍子病毒 胸腺嘧啶激酶）基因阴性筛选标记。 ;Neo新霉素基因阳性的ES细胞可以再含有G418（一种新霉素的类似物）的培养基上生长。 HSV-tk基因阳性的ES细胞，编码的基因产物可以将更昔洛韦等转化为有毒物质，将细胞杀死。;胚胎干细胞（简称ES细胞） 胚胎干细胞是早期胚胎中分离出来的一类细胞， ;（1）基因敲除载体的构建 Step1. 获得目的基因（待敲除基因）的同源片段，将此DNA片段克隆到一般质粒中； Step 2. 从重组质粒中切除目的基因的大部分同源序列，只留部分序列在线性质粒载体的两端； Step 3. 将neo基因和HSV-tk克隆到质粒中；; 根据载体与靶基因组同源序列双链断裂位点位置的不同，基因载体通常分为两种： 1．插入性载体(gene-insertion vector) 　　 2．置换型载体(gene-replacement vector) 大多数的基因敲除中，采用的是置换性载体；而插入性载体则更多的应用于基因敲入和对目的基因的精确突变。;（2）基因敲除载体导入ES细胞 将基因敲除载体导入ES细胞，以载体上的neo基因置换ES细胞基因组的目的基因，从而得到 基因敲除细胞 ; 基因敲除载体导入ES的方法有显微注射法，电穿孔法，DEAG葡聚糖介导法，脂质体法，病毒感染法，精子载体法等; 1.正负双向筛选系统（PNS）： Nero???因表达，ES细胞抗新霉素，在G418的培养基中存活。 HSV-tk基因表达，在更昔洛韦的培养基中，ES细胞被杀死。 ; 2.正向筛选 又称标记基因的特异性表达法，仅有正性选择性标记的标记基因，而且这种标记方法是缺乏自身的某个表达调控序列。 标记基因因为特异整合，获得调控序列，能够表达。 可以分为无启动子筛选法， 无增强子筛选法， 无poly（A）筛选法。 ;3．物理筛选方法 主要是PCR筛选方法，优点是灵敏，专一性强；。 此外还有富集或筛选率比较高时，可以用Southern blot杂交法， ;（3）基因敲除的ES细胞注射入胚泡 （4）胚泡植入假孕小鼠的子宫中 ; 导入动物胚胎后，可以发育成嵌合子或完全ES来源的动物。 嵌合体动物与正常的动物杂交，子代动物再杂交，有可能产生杂合型突变体。;得到纯合体： 由于同源重组常常发生在一对染色体上中一条染色体中,所以如果要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型，需要进行至少两代遗传。;一、条件性基因敲除法： 将某个基因的修饰限制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定阶段的一种特殊的基因敲除方法。 在传统基因敲除的基础上，利用了特异性重组酶系统作为调控的按钮，实现对基因的时刻可调节敲除。 与Cre-loxp重组酶系统有关。; 条件性基因敲除优点： ① 目标基因的敲除可以限定在特定的组织、细胞或发育的特定阶段； ② 可避免因基因突变而致死胎的问题： ③ 在2 个loxP 位点之间的重组率较高； ④ 如用病毒或配体／DNA 复合物等基因转移系统来介导Cre 的表达，则可省去建立携带Cre的转基因动物的过程。 常见的几种诱导性类型如下：四环素诱导型；干扰素诱导型；激素诱导型；腺病毒介导型。; 二、体细胞基因敲除 伴随核移植和体细胞克隆技术的发展，体细胞基因敲除-核移植体系为研究热点。 选择的体细胞应该有较好的繁殖能力和克隆能力。有时用带端粒酶基因的