第8章大肠杆菌基因表达系统.ppt

第八章 大肠杆菌基因表达系统;克隆基因的表达：;一、原核表达系统的注意事项;除了具备克隆载体具备的条件外，还应具备以下条件： 1.强启动子、强转录终止子 2.可诱导性 3.合适的核糖体结合位点和起始密码ATG等;A dividing E. coli;① 必须是一种强启动子;Plac;色氨酸启动子trp;cI857:;三、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位;;2. 周质中表达;phoA、OmpA、OmpT、OmpF、LamB、β-内酰胺酶（lactamase）;鼠源RNase、人生长激素信号肽。;用溶血素（hemolysin）基因构建分泌性融合蛋白；;;载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的任何蛋白质融合在一起。;哈佛大学的Gilbert实验室建立的。表达能力强。;;载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号肽连在一起，可被宿主菌分泌到细胞周质中。;;pIN III-comA1;表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的菌体蛋白连接在一起的。;lacI;（4）产物分离;pGEX; ;（5）其他融??蛋白系统;（2）-35区与-10区之间的距离;5’-AGGAGGU-3’;AUG左侧的三个碱基也有影响。;3. 启动子与外源基因之间的距离;4. 转录终止区对表达效率的影响;选择强启动子序列，如tac 等;;cI857阻遏物有活性，抑制?PL启动子，外源基因不表达，宿主大量生长。;调节基因lac I（位于宿主基因组内或载体上）始终产生阻遏物。;（2）表达载体诱导复制 ;N末端：由原核基因编码一段多肽， C末端：是完整的真核外源基因。;①使用lon-菌株，减少宿主菌的蛋白酶合成。 ② T4噬菌体的pin基因产物能抑制细菌的蛋白酶。可把pin增加到载体上。;（3）表达分泌蛋白 ;细菌蛋白分泌的条件：;