山药多糖对葡萄糖苷酶抑制实验设计.doc

第  PAGE \* MERGEFORMAT 6 页 共  NUMPAGES \* MERGEFORMAT 6 页 山药多糖提取物对葡萄糖苷酶的抑制实验 2 0 1 6 年5 月一．所需试剂 （1）PBS缓冲液?? 称取8g?NaCl、0.2g?KCl、1.44g?Na2HPO4和0.24g?KH2PO4,溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至6.8，最后加蒸馏水定容至1L 称取NaCl?8g，KCl?0.2g，Na2HPO4?12H2O?3.63g,?KH2PO4?0.24g，溶于900ml双蒸水中，用盐酸调pH值至6.8，加水定容至1L，常温保存备用。 实际配制500ML即可。 （2）3 mmol/L 谷胱甘肽溶液 谷胱甘肽分子量：307.32，称取46.1mg谷胱甘肽定容至50ml蒸馏水中，即为3 mmol/L 谷胱甘肽溶液。 （3）0.01 mol/L PNPG 溶液 4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷分子量：301.25,称取150.6mg定容至50ml蒸馏水中，即为0.01 mol/L PNPG 溶液。 （4）0.2 mol/L Na2CO3 溶液 Na2CO3分子量：105.99，称取2.12g定容至100ml,即为0.2 mol/L Na2CO3 溶液 实验流程 1】酶活性的测定 1.检测样配置 取67 mmol/L 磷酸盐缓冲液（pH 6.8）1.4 mL、 3 mmol/L 谷胱甘肽溶液40 μL， 0.01 mg/mL α-葡萄糖苷酶溶液60 μL， 37 ℃保温10 min 后， 加0.01 mol/L PNPG 溶液100 μL，摇匀， 37 ℃保温继续反应10 min， 加入0.2 mol/L Na2CO3 溶液800μL 终止反应， 于400 nm 波长处测定吸光值. 参比配置 取67 mmol/L 磷酸盐缓冲液（pH 6.8）1.4 mL、 3 mmol/L 谷胱甘肽溶液40 μL， 水60 μL， 37 ℃保温10 min 后， 加0.01 mol/L PNPG 溶液100 μL，摇匀， 37 ℃保温继续反应10 min， 加入0.2 mol/L Na2CO3 溶液800μL 终止反应， 于400 nm 波长处测定吸光值. 检测样吸光值为参比吸光值为 2】多糖提取物抑制α-葡萄糖苷酶活性的测定 1.待测样配置 A 配置浓度为2 mg/mL 的多糖酸性水提取物 分别取溶液20、40、60、80、100、150、200 μL，于10mL塑料试管中 各加入67 mmol/L pH 6.8 的磷酸缓冲液至1.4mL 加3 mmol/L 谷胱甘肽溶液40 μL 0.01 mg/mL α-葡萄糖苷酶溶液60 μL， 37 ℃保温10 min 加0.01 mol/L PNPG 溶液100 μL，摇匀 37 ℃保温继续反应10 min 加入0.2 mol/L Na2CO3 溶液0.8 mL 终止反应 于波长400 nm 处测定吸光值 B 配置浓度为2 mg/mL 的多糖酸性氯化钠提取物 分别取溶液20、40、60、80、100、150、200 μL，于10mL塑料试管中 各加入67 mmol/L pH 6.8 的磷酸缓冲液至1.4mL 加3 mmol/L 谷胱甘肽溶液40 μL 0.01 mg/mL α-葡萄糖苷酶溶液60 μL， 37 ℃保温10 min 加0.01 mol/L PNPG 溶液100 μL，摇匀 37 ℃保温继续反应10 min 加入0.2 mol/L Na2CO3 溶液0.8 mL 终止反应 于波长400 nm 处测定吸光值 C 配置浓度为2 mg/mL 的多糖中性水提取物 分别取溶液20、40、60、80、100、150、200 μL，于10mL塑料试管中 各加入67 mmol/L pH 6.8 的磷酸缓冲液至1.4mL 加3 mmol/L 谷胱甘肽溶液40 μL 0.01 mg/mL α-葡萄糖苷酶溶液60 μL， 37 ℃保温10 min 加0.01 mol/L PNPG 溶液100 μL，摇匀 37 ℃保温继续反应10 min 加入0.2 mol/L Na2CO3 溶液0.8 mL 终止反应 于波长400 nm 处测定吸光值 2.空白样配置 取水100 μL 各加入67 mmol/L pH 6.8 的磷酸缓冲液至1.4mL 加3 mmol/L 谷胱甘肽溶液40 μL 0.01 mg/mL α-葡萄糖苷酶溶液60 μL， 37 ℃保温10 min 加0.01 mol/L PNPG 溶液100 μL，摇匀 37 ℃保温继续反应10 min 加入0.2 mol/L Na2CO3 溶液0.8 mL 终止反应 于波长400 nm 处测定