核酸的变性和复性.PDFVIP

核酸的變性和復性 ? DNA 的變性 ? DNA 的復性 ? 核酸分子雜交 ?變性(denaturation)和復性(renaturation) 是雙鏈核酸分子的二個重要物理特 性。也是核酸研究中經常引用的術語。雙股 DNA，RNA 雙鏈區，DNA：RNA 雜交雙鏈(hybrid duplex)以及其他異源雙鏈核酸分子(heteroduplex) 都具有此性 質。 (1) DNA 的變性： ?指 DNA 分子由穩定的雙螺旋結構鬆解爲無規則線性結構的現象。確切地就 是維持雙螺旋穩定性的氫鍵和疏水鍵的斷裂。斷裂可以是部分的或全部的，是可 逆的或是不可逆的。DNA 變性不涉及到其一級結構的改變。凡能破壞雙螺旋穩 定性的因素都可以成爲變性的條件，如加熱、極端的 pH、有機試劑：甲醇、乙 醇、尿素及甲醯胺等，均可破壞雙螺旋結構引起核酸分子變性。變性能導致 DNA 以下一些理化及生物學性質的改變。 ?溶液粘度降低 ：DNA 雙螺旋是緊密的剛性結構，變性後代之以“柔軟” 而鬆散的無規則單股線性結構，DNA 粘度因此而明顯下降。 ?溶液光性發生改變 ：變性後整個 DNA 分子的對稱性及分子局部的構性改變， 使 DNA 溶液的光性發生變化。 ?增色效應或高色效應 (hyperchromic effect)：指變性後 DNA 溶液的紫外吸收 作用增強的效應。DNA 分子具有吸收 250－280 nm 波長的紫外光的特性，其吸 收峰值在 260 nm。DNA 分子中鹼基間電子的相互作用是紫外吸收的結構基礎， 但雙螺旋結構有序堆積的鹼基又束縛了這種作用。變 性 DNA 的雙鏈解開，鹼 基中電子的相互作用更有利於紫外吸收，故而産生增色效應。一般以 260 nm 下 的紫外吸收光密度作爲觀測此效應的指標，變性後該指標的觀測值通常較變性前 有明顯增加，但不同來源 DNA 的變化不一，如大腸桿菌 DNA 經熱變性後，其 260 nm 的光密度值可增加 40%以上，其他不同來源的 DNA 溶液的增值範圍多在 20－30%之間。 ?以加?? 爲變性條件時，增色效應與溫度有十分密切的關係，這主要是變性溫 度取決於 DNA 自身的性質。熱變性使 DNA 分子雙鏈解開所需溫度稱爲熔解溫 度( melting temperature,簡寫 Tm)。因熱變性是在很狹的溫度範圍內突發的躍變過 程，很像結晶達到熔點時的熔化現象，故名熔解溫度。若以溫度對 DNA 溶液的 紫外吸光率作圖，得到的典型 DNA 變性曲線呈 S 型。S 型曲線下方平坦段，表 分子生物學總論 51 陳世明 整理 示 DNA 的氫鍵未被破壞，待加熱到某一溫度處時，次級鍵突發斷開，DNA 迅速 解鏈，同時伴隨吸光率急劇上升，此後因無鏈可解而出現溫度效應喪失的上方 平坦段。Tm 定義中包含了使被測 DNA 的 50%發生變性的意義，即增色效應達 到一半的溫度作爲 Tm，它在 S 型曲線上，相當於吸光率增加的中點處所對應的 橫坐標。不同來源 DNA 間的 Tm 存在差別，在溶劑相同的前提下，這種差別主 要是由 DNA 本身下列兩方 面的性質所造成的。(1)DNA 的均一性：有二種含義，首 先是指 DNA 分子中鹼基組 成的均一性，如人工合成的 只含有一種鹼基對的多核苷 酸片段，與天然 DNA 比較， 其 Tm 值範圍就較窄。因前 者在變性時的氫鏈斷裂幾乎 可齊同進行，故所要求的變 性溫度更趨於一致。其次還 包含有待測樣品 DNA 的