免疫组化2_基本原理.pptVIP

免疫组织化学技术; 抗原＋抗体（特异性）＋标记物，原位显示组织或细胞内抗原的一门技术。;根据抗体标记物不同： 酶---免疫酶组织化学 荧光素---免疫荧光组化 胶体金---免疫胶体金组化 高亲和力物质---亲和免疫组化; 其中，免疫酶组织化学应用广泛 以其为例，掌握免疫组化基本原理;酶选择标准： ★ 该酶用细胞化学易于被检出，能被光镜或电镜观察。 ★ 酶反应产物须稳定，不扩散，具有良好定位。;符合上述条件： 辣根过氧化物酶---HRP 硷性磷酸酶---AKP 葡萄糖氧化酶---GOD;（一）辣根过氧化物酶（HRP） ★ 分子量（40000），不会遮盖抗原的结合部位 ★ 稳定，易获得较高纯度酶 ★ 具有较高活性及特异性;HRP的底物：低浓度的H2O2，供氢体为胺类及酚类化合物。 ;HRP常用的电子供体： ● 3.3-二氨基联苯胺(DAB)～棕色 ●氨乙基卡巴唑(AEC)～红色，易溶于有机溶剂，易扩散，用水溶性封固剂。; （二）硷性磷酸酶（AKP） 从小牛肠粘膜或大肠杆菌中提取 ● 组织穿透能力较弱 ● 内源性AKP较高 ● 左旋咪唑具有抑制作用 ;AKP底物： AKP常用的底物为α-萘酚AS-B1磷酸盐 偶联试剂：固兰BB～蓝色 固红TR～红色 ; （三）葡萄糖氧化酶（GOD） 底物为葡萄糖，终产物稳定 ● 体内无内源性GOD ● 分子量大，穿透力较弱 ; 第一节 基 本 原 理 ; 酶标记抗体法（Enzayme Labelled antibody）是将酶通过共价键结合在抗体分子上，制备成酶标记抗体，通过抗体去寻找相应抗原。 ;组织抗原;步骤：一步完成 优点：简便、省时 特异性强，非特异染色轻 缺点：敏感性差 一种标记抗体只能检测一种抗原;组织抗原;优点：较直接法敏感性高 一种标记抗体能用于相应动物制备的多种特异性抗体，检测多种抗原 缺点： 较直接法费时 非特异性染色稍重 ;● 制备抗酶抗体 ● 制备PAP复合物;酶桥法;优点：与酶标记抗体法相比，敏感性高 （酶与三抗通过抗原-抗体反应 结合，避免直接标记引起两者活性降低） 缺点： 较费时 ;一、PAP法 原理：抗原---特异性抗体---第 二抗体（桥抗体）--- PAP复合物;组织抗原;优点：敏感性较高 背景染色较轻 局限：特异性抗体与PAP必须为同一种属动物 ;APAAP法（碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶复合物法）;优点：非特异背景较轻，不受内 源性酶的干扰 缺点：产物易溶于有机溶剂 ;组织抗原;步骤：五步法 优点：敏感性较高 缺点：步骤多，费时 非特异性背景重;Avidin---一种硷性糖蛋白，由四个相同亚基组成 Biotin---小分子维生素 Avidin和Biotin具有较高亲和力，比普通抗原抗体亲和力高百万倍以上;;步骤：三步法 优点：敏感性较高 特异性强 应用范围广 缺点：某些脏器存在内源性生物素干扰 Avidin与糖基、纤维组织、核酸及细胞膜中磷脂有非特异反应 ;（二）SABC法（Streptavidin biotin Peroxidase Complex） 比较亲和素，链霉亲和素造成的背景着色浅 SABC法已代替ABC法; （三）LSAB法（ Labelled Streptavidin Biotin Method）---又称链霉亲和素-过氧化物酶法（SP法）;步骤：三步法 优点：敏感性高 特异性强，背景浅淡 方法简便 ;六、多聚合物酶法;组织抗原;步骤：一步法 优点：快速，简便，特异性强， 敏感性高 缺点：商品化种类不全， 价格昂贵;组织抗原;步骤：二步法 优点：敏感性高（1 mole复合物中含70mole HRP和10 mole第二抗体） 特异性强（复合物内无内源性Avidin和Biotin的干