流式细胞仪剖析的技术.pptVIP

流式细胞仪分析技术; 流式细胞术(flow cytometry, FCM)是20世纪70年代发展起来的一种以流式细胞仪为工具，能快速测量细胞的物理或化学性质，如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等，并可对其分类、收集的高新技术。; 流式细胞术（FCM）借鉴了荧光显微镜技术, 同时利用计算机技术、激光技术、电子技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学等多门高新技术的发展, 将荧光显微镜的激发光源改为激光, 使之具有更好的单色性与激发效率, 因而大大提高了检测灵敏度, 同时将固定的标本台改为流动的单细胞悬液, 用计算机进行数据处理, 从而大大提高了检测速度与统计精确性, 而且从同一个细胞中可以同时测得多项参数, 被誉为是细胞分析领域的“CT”。; 流式细胞术（FCM）以其快速、灵活、大量、灵敏和定量的特色，广泛应用于基础研究和临床实践各个方面，包括细胞生物学、肿瘤学、血液学、免疫学、药理学、遗传学及临床检验学等，在各学科领域发挥着重要的作用。;第一部分 流式细胞仪的分析及分选原理 第二部分 数据的显示与分析 第三部分 流式细胞仪免疫分析的技术要求 第四部分 流式细胞术在免疫学检查中的应用 第五部分 应用举例; 流式细胞仪是将流体喷射技术、激光技术、空气技术、γ射线能谱术及电子计算机等技术与显微荧光光度计密切结合的一种非常先进的检测仪器。 ; 该仪器具有高度的精密性，测定的数据准确可靠。既可分析单个细胞，也能区分群体细胞，检测的速度可达5000个细胞/秒，分选纯度可高达99%以上。 由于该仪器的多参数性、准确性、快速性及分选的高纯度性等特点，所以在细胞生物学、免疫学、肿瘤学、病理学及临床医学等领域中得到越来越广泛的应用。 ;;细胞组成; 经荧光色素染色的细胞或包裹在鞘液里的其他生物微粒，从50－100μm的喷嘴逐个高速喷出，通过一个聚焦的光源，进而通过各种光敏元件测量这些细胞或微粒所发射的散射光以及荧光，经计算机分析和处理可得到多种信息参数。;结构示意图;单细胞液柱; （1） 液流系统 （2） 光学系统 （3） 数据处理系统;由样本和鞘液组成 待测细胞 单个细胞??悬液 荧光染料标记的单抗对其染色 受清洁气体压力 从样品管进入流动室形成样本流 鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。 ;喷嘴;FCM的液流系统（如何形成单个细胞流）;激光光源：气冷式氩离子激光器 分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长波长 光束成形器：两十字交叉放置的透镜 透镜组：形成平行光，除去室内光 滤片：长通、短通、带通 光电倍增管：FS, SS（散射光）， FL1, FL2, FL3, FL4（荧光）;;主要由计算机及其软件组成; 细胞在液柱中与激光束相交时向周围360°立体角方向散射的光线信号，它的强弱与细胞的大小、形状、胞内颗粒折射等有关，主要分为前向散射光和侧向散射光。;; 前向散射光（forward scatter, FS）：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度(0.5°～10°)向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。;FALS Sensor; 侧向散射光（side scatter, SS）：激光束照射细胞时，光以90°角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。;FALS Sensor; 测得的FS与SS信号通过计算机处理，可得到FS-SS图，由此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进行分析或分选。 此为血细胞分类的基本原理，但不能分析表面分子。;荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。 每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光电倍增管。 选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征。 线性放大器和对数放大器;荧光染料的特性;;荧光补偿; 通过流式细胞仪进行细胞分选主要是在对具有某种特征的细胞需进一步培养和研究时进行的。;细胞悬液形成液流柱;分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬液中细胞的含量成正比。 分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞的百分率。 分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。 分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。与分选速度成反比。;参数：FS,SS,FL 数据显示方式 （单参数直方图 、双参数散点图 、二维等高图 、假三维等高