传递窗紫外消毒方法.docx

4.3.1棉球擦抹法? 将要传递的物料按最大装载放置，过一定的时间后，在物料表面取样检查，每件物料表面取三点。 ?4.3.2生物指示剂法? 4.3.2.1选用枯草芽孢杆菌，使用前测定其初期菌数，应不少于10个。? 4.3.2.2在消毒灭菌前，将装有生物指示剂表皿置于传递窗内的周边及中间部位灭菌前打开表皿，灭菌结束后，回收生物指示剂放入大豆酪素消化液体培养基中，在37℃下培养3天，看细菌是否被杀灭，若没有细菌生长，则为合格。? 4.3.2.3表皿放置图?????? 细菌芽孢悬液的制备：? 8.1.1.1?取枯草芽孢杆菌增菌液适量至营养琼脂培养基斜面，使菌液布满营养琼脂培养基斜面，30～35℃培养5～7天。用接种环取菌样少许涂于玻片上，固定后以改良芽孢染色法染色，并在显微镜（油镜）下进行镜检。当芽孢形成率达95％以上时，即可进行以下处理。否则，应在室温下放置一定时间，直至达到上述芽孢形成率后再进行以下处理。? 8.1.1.2?取适量无菌水于营养琼脂培养基斜面，以L棒轻轻推刮下菌苔。吸出第一批洗下的菌悬液，再取适量无菌水于营养琼脂培养基斜面，重复洗菌一遍。将第一和第二批洗下的菌悬液集中于一含玻璃珠的无菌三角烧瓶内，振摇5min，打碎菌块，使成均匀的芽孢悬液。? 8.1.1.3?将芽孢液放于80℃水浴中10min（或60℃，30min），以杀灭残余的细菌繁殖体。? 待冷至室温后，保存于4℃冰箱中备用。有效使用期为半年。? 8.2?稀释液? 1％蛋白胨—PBS溶液：取磷酸二氢钾1.36g、磷酸氢二钠2.83g、蛋白胨10.0g，加水1000ml，微温溶解，分装，置高压灭菌器121℃×30分钟灭菌。? 8.3?菌片的制备? 8.3.1?试验中使用的菌片是以菌液滴加于载体上制成（1.0cm×1.0cm的不锈钢片）。所用载体染菌前应进行脱脂处理。脱脂方法如下：①将载体放在含肥皂的水中煮沸30min；②纯化水洗净；③纯化水煮沸10min；④用纯化水漂洗至pH呈中性；⑤晾干备用。? 8.3.2?载体经灭菌后使用滴染法染菌。将灭菌载体平放于灭菌平皿内，每个载体滴注10ul菌悬液，用10ul移液器接灭菌塑料吸头，滴染菌液，并用接种环涂匀整个载体表面。滴染菌液后，染菌载体可置超净台上晾干后使用。? 8.3.3?每个菌片的染菌量即回收菌量应为1×105～5×106cfu/片。? 8.4?载体定量消毒试验? 8.4.1?取4种菌染菌载片各4个。开启紫外灯5min后，将16个染菌载片平放于无菌平皿内，水平放于紫外线强度最弱的位置处照射，于4个不同间隔时间（15min、30?min、45?min、60min）各取出1个染菌玻片，分别投入4个盛有10ml稀释液的试管中，用电动混匀器震荡20s或振打80次洗脱载片上的菌体。? 8.4.2?取洗脱液或其稀释液1ml，作平板倾注。细菌放30～35℃培养48小时做活菌计数，真菌放23～28℃培养72小时做活菌计数。? 8.4.3?阳性对照，除不做照射处理外，操作同上。? 8.4.4?杀灭对数值计算? 杀灭对数值（KL）＝对照组活菌浓度对数值-试验组活菌浓度对数值? 8.4.5 消毒合格时间? 在照射强度最弱处，对细菌及其芽孢和真菌的杀灭对数值≥3所需的时间即为消毒合 格时间。其它传递窗，确定最弱照射强度后，根据所需照射剂量确定消毒合格时间。?照射剂量（uW·s/cm2）＝紫外线照射强度（uW/cm2）×时间（s） 挑战性实验对紫外线消毒效果及消毒时间进行验证，确认紫外线消毒效果及消毒所需时间。?验证程序：? 紫外线消毒前，将塑料管内的生物指示剂菌片无菌移入（用灭菌后的镊子）到灭菌后的培养皿中（一个培养皿放三个菌片），用灭菌后的大头针支起，尽量让菌片两面接触空气，，裸露在空气中，紫外线消毒时放在自净式传递窗内合适的位置（关键部位、离高效和回风口最远的地方），开启紫外灯及自净风机开始进行消毒，分别做在消毒开始后10分钟、15分钟、20分钟三次实验，每次结束后用无菌操作的方法（用灭菌后的镊子）将培养皿中的菌片（每次一片）移入到装有枯草芽胞杆菌培养液的塑料管内拧紧，做好状态标记，放入密封容器保存。? 培养及结果观察：分别将臭氧消毒不同时间段取出的生物指示剂置于恒温箱中37℃进行培养，同时取一支未经灭菌的枯草芽胞菌片加入枯草芽胞杆菌培养液内的塑料管中作阳性对照，经48小时培养后,阳性对照的培养液应呈浑浊生长,培养液由红变黄。经灭菌后培养的菌片液体应澄清，培养液仍为原来的红色。经初步观察后再继续培养7天，结果仍与第一次观察的结果一样，则判为验证合格。根据培养的结果判断紫外线消毒的效果。? 注：生物指示剂名称：枯草芽胞杆菌（Bacillus?Subtilis?Atcc6633）? 生物指示剂性状：圆片形、红色液体?生物指示剂含菌量：