第6章常用分子生物学技术的原理及应用.ppt

第六章;第一节 分子生物学发展概述;分子生物学molecular biology是在分子水平上研究生物的结构、组织和功能的科学。 1950年，Astbury在一次学术报告中，首次提出并使用了分子生物学这一名词术语。 医学分子生物学是应用分子生物学技术和理论来阐明人体正常生理活动和病理过程及其调控的分子机理的一门科学。;一、分子生物学一些重要的理论知识;（4）1910年，现代实验遗传学奠基人TH.Morgan和他的研究生在研究果蝇的遗传规律时发现了基因的连锁律和交换律。 （5）1944年，OT.Avery等人（3人）分离出细菌 DNA，并发现DNA是携带生命遗传物质的分子。 （6）1950年，Astbury在一次演讲中，首次使用了 “分子生物学” 术语。 ;（7）1953年，Watson和Crick提出了DNA结构的双螺旋模型，揭示了遗传物质自我复制的机制。 （8）1961年至1966年，Nirenberg和Crick 等人破译了DNA遗传密码，1966年 破译了64个遗传密码。 提出了遗传信息由DNA → RNA→蛋白质传递的中心法则。 （9）1969年，Jonathan Beckwith及其同事在哈佛大学成功分离出第一个基因。;（10） 1961年，F.Jacob和J.Monod提出了乳糖操纵子学说。 （11）1970年，发现了逆转录酶。 （12）自1946年起的20年当中，陆续发现了许多质粒；1968年至1970年又发现了许多限制性内切酶，为DNA体外重组提供了有利工具。 （13）1973年，重组DNA技术问世。 （14）1986年，K.Mullis等建立了PCR技术 （15）1990年，人类基因组计划。;DNA的结构、复制、中心法则 基本构成单位是核苷酸 核苷酸由脱氧核糖、碱基和磷酸构成。 碱基分别是腺嘌呤 (A)、鸟嘌呤 (G)、胸腺嘧啶 (T)和胞嘧啶(C)。 相邻的两个核苷酸以磷酸二酯键相连 进一步盘旋、折叠，形成三级或四级结构; 五碳糖为核糖(不是脱氧核糖)； 碱基中有尿嘧啶U(uracil)而没有胸腺嘧啶 RNA为单链，不是双链，但RNA单链之间相邻的碱基可由氢键作用形成局部双链。 DNA存在于细胞核的染色体、线粒体以及染色体以外的质粒中(质粒是一些双链，闭环的DNA分子)。;;③DNA在细胞中存在部位不同(细胞核、线粒体、质粒)，所以应注意提取方法的不同 ④由于DNA空间构象不同，在电泳时迁移率不同。 ⑤根据碱基互补配对原则，可设计引物和探针杂交。 ⑥由于DNA的双螺旋结构和RNA易由于分子内氢链作用形成二级结构，所以在进行杂交等反应时，首先应加热变性，破坏二级结构。; 在解旋酶的作用下，打开DNA双链 在特定的复制起始点 以每条DNA链为模板 在DNA聚合酶的催化下 以4种脱氧核苷酸为前体物，合成一条互补DNA链。 DNA的复制称为半保留复制。;DNA 半 不 连 续 复 制 ; ① PCR技术的原理：在体外要靠温度(90℃以上)打双链，而不是解旋酶，也是以DNA为模板，需要引物，需DNA聚合酶，需要dNTP为前体。PCR与体内(细胞内)DNA复制的最大差异是温度。 ②检测核分裂指数：在细胞培养中，加入3H标记的dNTP前体物，被细胞摄取后，参与DNA复制，复制速度越快，参入的3H标记的dNTP越多，可用液闪计数仪检测放射性强度，据此判断。;遗传信息的传递是： DNA→RNA→多肽(蛋白质) 在逆转录酶的作用下，RNA可形成cDNA，然后再由RNA→蛋白质 以上就是完整的中心法则理论，亦可称为基因的表达(expression)。;中 心 法 则;反义链 ;;由RNA →蛋白质的过程，又叫翻译。只有聚合酶II催化的反应产物是mRNA，而只有mRNA才翻译成蛋白质。 基因(DNA)上三个相邻的碱基组成一个密码子，一个密码子决定一种特定的氨基酸，共有43=64个密码子。 在转录过程中，基因上的三联密码子转录成mRNA上的三联密码子。 mRNA由核内转移至细胞浆中的核糖体上，以三联密码子指导合成蛋白质。 翻译后的蛋白质需要加工修饰。 ;中心法则给了我们一些启示：; ③基因的表达有组织特异性，且受许多因素的影响，使mRNA的表达增强、降低甚至关闭，从而影响机体正常生理功能，甚至出现疾病。 因此常需要检测mRNA的表达的丰度(含量)，常用方法有Northernblot、RT-PCR。定量(Real time)PCR等。 这里需要特别强调：在检测mRNA(或蛋白)表达时，一定要先弄清该基因在某种组织中是否有表达。; ④根据中心法则，可以RNA为模板，在逆转录酶作用下形成cDNA，于是建立了RT-PCR的方法。 ⑤根据mRNA的3’端有po