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分子生物学实验报告
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一、前期工作及引物设计
(一)实验目的:
寻找一个合适的基因,并设计出与之相对应的引物,用于后续实验。
(二)实验原理:
引物设计的一般原则:
① 引物长度:15-30bp
② GC含量:一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%
③ 退火温度:退火温度需要比解链温度低5℃,如果引物碱基数较少,可以适当提高退火温度,这样可以使PCR的特异性增加
④ 避免扩增模板的二级结构区域
⑤ 与靶DNA的错配:当被扩增的靶DNA序列较大的时候,一个引物就有可能与靶DNA的多个地方结合,造成结果中有多个条带出现。这个时候有必要先使用BLAST软件进行检测
⑥ 引物末端:引物3’端是延伸开始的地方,因此要防止错配就从这里开始。3’端不应超过3个连续的G或C,因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。
⑦ 引物的二级结构:引物自身不应存在互补序列,否则引物自身会折叠成发夹状结构,这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。
(三)操作方法:
1、阅读一些与小麦抗旱基因相关的文章,并最终选出基因TAPK7。
LOCUS AB125308 1583 bp mRNA linear PLN 15-FEB-2008
2、根据引物设计原则,用相关软件Primer6设计两对引物。
3、在网站NCBI上用BLAST检验所设计的引物,并从中选出较好的一对引物。
(四)实验结果:
前引物:5’-CCAACATCATCCGCTTCA-3’(position:396 引物长度:18)
后引物:5’-CCTGCTCATCCTCCTCTT -3’(position:1190 引物长度:18)
(产物长度795)
(五)讨论:
虽然我们自己设计出来引物,但是后来做PCR的效果也不好,后来还换了引物。所以希望老师能在这些我们还未学习到的地方给一些经验指导,或者提供一些资料参考,来保证我们的实验效果。
二、目的基因提取及验证
(一)实验目的:
根据所设计的引物,用克隆基因组和反转录两种方法,得到目的基因cDNA。
(二)实验原理:
1、提取基因组:十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)是一种去污剂,可溶解细胞膜,它能与核酸形成复合物,在高盐溶液中是可溶的,当降低溶液盐浓度到一定程度时,从溶液中沉淀。在本实验方案中,首先通过含有CTAB高盐抽提液使DNA充分溶出,然后加入氯仿使蛋白和细胞碎片沉淀,离心后,溶液分为三层,上层为CTAB与核酸的复合物的高盐溶液,中层为蛋白质和细胞碎片,下层为氯仿。取出上清加入异丙醇使核酸沉淀。
2、提取RNA:DNA和RNA的溶解性不同,DNA在1M的盐溶液中具有最好的溶解度,而RNA在0.14M的盐溶液中具有最好的溶解度,所以可以利用它们的溶解性将它们进行区分。RNA提取的另一个关键问题就是抑制或去除环境中RNA酶,判断RNA 的质量主要有两个标准,一是纯度,二是完整性(是否被降解)。
3、利用提取的基因组和设计好的引物一起做PCR,便可得到目的基因。利用提取的RNA和设计的引物一起做RT-PCR,便可得到目的基因的cDNA。之后再做电泳检验扩增出的条带是否和目的基因的分子量大小相符。
(三)实验步骤:
(1)基因组DNA提取
1. 取0.15g左右小麦叶片,在液氮中研磨后放入1.5ml离心管中,加入700μl抽提液(65℃预热)混匀,加4 ul RNase室温静置2min。放入65℃水浴中,裂解40-60分钟,期间温和混匀几次。
2. 取出裂解好的DNA ,加入700μl 氯仿:异戊醇(24:1),猛烈混匀,离心(10000rpm,10分钟)。
3. 取上清于新管中,(不要混入氯仿),加入0.8-1倍预冷异丙醇,缓慢混匀后,再猛烈混匀,使DNA成团,-20℃放置半小时以上。
4. 将析出的DNA 离心,14000rpm,10分钟。
5. 去掉上清,将沉淀用1ml 70% 乙醇清洗一次,挥发除去乙醇,溶于50μl TE或水中。
(2)提取RNA:
1. 称取小麦叶片50-100mg,于研钵中加液氮研磨成粉末,迅速转移到1.5ml离心管中。
2. 加入1 ml Trizol Reagent,15~30℃×5min。
3. 加入0.2ml氯仿,剧烈振荡15 sec,15~30℃×3min。
4. 冷冻离心12 000 rpm×15min。
5. 将上清液转移到另一个离心管中,加0.5ml预冷异丙醇,混匀,-20℃放置20min。
6. 冷冻离心12 000 rpm×10min,弃上清。
7. 加入0.
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