分析化学高效液相色谱_HPLC.pptVIP

第8章 高效液相色谱法 HPLC High Performance Liquid Chromatography; §8.1 高效液相色谱仪 四大部分组成： 溶剂输送系统（贮液器，高压泵） 进样系统（进样阀等） 分离系统（色谱柱等） 检测记录系统（检测器，记录仪等） ;;;;1. 高压输液泵 主要部件之一，压力：150～350×105 Pa 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10μm），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一 应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性;2. 进样装置;3. 分离系统 包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。 色谱柱一般用内部抛光的不锈钢制成。其内径为2 ~ 6mm，柱长为10 ~50cm，柱形多为直形，内部充满3～10 mm高效微粒固定相。柱温一般为室温或接近室温 匀浆法填充柱： 将填料制成悬浮液，在高压泵的作用下压入装有洗脱 液的色谱柱。理论塔板数可达8万/米 ;;4. 检测器 要求: 灵敏度高，噪音低，线形范围宽，响应快, 对温度和流速的变化不敏感 两种类型 溶质型检测器： 仅对被分离组分的物理或理化性质响应 如紫外，荧光，二极管阵列，电化学检测器 总体型检测器: 对试样和洗脱剂均有响应 如示差折光，介电常数检测器 ;UV检测器最常用，占70％ 池体积: 1～10μL 光程常: 2～10 mm 波 长: 254 nm 窗 口: 石英 ;折光计由测量池和参比池组成（示差折光计）; 伏安计、安培计、库仑计和电导计等, 首选安培计 可用于在工作电极的工作电压范围能还原或氧化的物质 电极表面易中毒 ;;5. 梯度洗脱 分配比 k 相差很大的复杂混合物用一种溶剂很难完全分开 可采用两种或两种以上极性不同但可以相互溶解的溶剂，随时间按一定比例混合，连续改变洗脱剂的极性,离子强度或pH，以便改变被测组分的相对保留值，达到提高分离效果，缩短分析时间的目的;梯度洗脱装置分为两类： 外梯度装置（又称低压梯度），流动相在常温常压下混合，用高压泵压至柱系统，仅需一台泵即可。 内梯度装置（又称高压梯度），将两种溶剂分别用泵增压后，按电器部件设置的程序，注入梯度混合室混合，再输至柱系统。 梯度洗脱的实质：通过不断地变化流动相的强度，调整混合样品中各组分的 k 值，使所有谱带都以最佳平均 k 值通过色谱柱。 它在LC中所起的作用相当于GC中的程序升温： 通过改变溶质的极性、pH值和离子强度来调节溶质的k值，在GC中借程序调节温度改变k值。;;§8.2 几种常见的液相色谱形式;1. 液液色谱（分配色谱） 1941年Martin发明: 用吸着在硅胶上的水作为 固定相，用氯仿为流动相 应用范围：最常用方法。 相对分子量小于3000，不带电的极性化合物; 固定液的流失 样品一定要在两相中均能溶解才能分,分离，因而两相在某种程度上互溶 长时间使用将导致固定液流失，不利分离 防止固定液流失的方法 ???;防止固定液流失的方法 方法一: 抑制柱 在分析柱之前，加一根与分析柱有相同固定液的预处理柱，在试样进样前，让流动相预先通过预处理柱，以便使流动相预先被固定液饱和，而使分析柱的固定液不受损失 缺点：麻烦 不能采用梯度洗脱技术 ;方法二: 化学键合固定相 将固定液以Si-O-R键合在SiO2载体表面 ;;;反相色谱 固定液为非极性 洗脱液为极性，如水（常用方法, 75%) C18柱（十八烷基化的SiO2填充柱）为标准色谱柱 应用：醇类、芳香族、蒽醌素、抗菌素、低聚物、甾族化合 物, 维生素等极性不太大的组分 ;; 2. 液固色谱(吸附色谱) 分离原理 固定相为固体吸附剂，被分离组分在固定相上的吸附作用不同来进行分离的 固体相: 极性的硅胶，Al2O3, MgSiO3等 硅胶柱的柱效高，容量大，最常见 流动相 “相似相用”: 如极性大的组分选用极性强的洗脱剂，否则不易被洗脱。洗脱液的极性可用溶剂强度参数 e 表征， e 越大，极性越强 应用 分离极性不同