DNA修饰-其检测的技术.pptxVIP

第四节：DNA修饰;CpG岛（CpG Island）;DNA甲基化的作用;用组蛋白Hl与含CCGG序列的甲基化和非甲基化DNA实验后发现： 甲基化达到一定程度时会发生从常规的B-DNA向Z-DNA的过渡。又由于Z-DNA结构收缩，螺旋加深，使许多蛋白质因子赖以结合的元件缩入大沟而不利于基因转录的起始。 DNA甲基化导致某些区域DNA构象变化，影响蛋白质与DNA的相互作用；抑制转录因子与启动区DNA的结合效率。 用序列相同但甲基化水平不同的DNA为材料，比较其作为RNA聚合酶转录模板的活性，发现甲基的引入不利于模板与RNA聚合酶的结合，降低了其体外转录活性。 5-甲基胞嘧啶在DNA上并不是随机分布的，基因的5端和3’端往往富含甲基化位点，而启动区DNA分子上的甲基化密度与基因转录受抑制的程度密切相关. ;组织培养的细胞由于甲基化作用，使细胞系不能表达出相应的组织特异性蛋白质。 2006年制备了拟南芥的全基因组甲基化图谱，发现转录区域1/3以上的表达区域出现了甲基化；而启动子区有少于5％的基因出现了甲基化；在转录区域的甲基化表现出了明显的组织特异性。 甲基化通常发生于外源序列中，使其处于异染色质状态，是寄主抵御外源序列入侵的策略，是1种主动防御机制。 ;DNA甲基化形成过程;CpG甲基化形成机制： 甲基化酶： Dam甲基化酶：催化GATC中的A甲基化（原核） Dcm甲基化酶：催化CCGG中2位C甲基化（原核，JM109,HB101） 真核生物甲基化酶：CpG的C形成5‘－甲基胞嘧啶 维持甲基化酶（maintenance DNA methyltransferase) (dnmt1) :在甲基化双链中只有亲代是甲基化的，而子代为非甲基化。此酶识别亲代甲基化位点，催化子代甲基化；对半甲基化的全甲基化催化效率非常高。一旦突变，导致全基因组去甲基化，引发胚胎死亡 重新甲基化酶（de novo DNA methyltransferase)（dnmt3a和dnmt3b):使没有甲基化的双链发生甲基化；使早期胚胎发生重新甲基化；dnmt3b突变引发着丝粒不稳定，面部畸形和致死性免疫缺陷。;甲基化与去甲基化;CpG岛影响基因转录的机制 直接抑制转录复合物，如HAT（组蛋白乙酰化酶）、CA（辅助激活因子）、TF（基础转录因子）；对甲基化敏感的TF有：AP-2,E2F,NFkB;不敏感的有Sp1。 基因表达时需要核小体松散、组蛋白乙酰化，这样可以吸引HAT、CA、TF等转录因子与DNA结合而启动转录。但CpG甲基化后，结合5－甲基胞嘧啶结合蛋白（如MBD1,MBD2,MBD3T,MBD4,Mecp2等，methylcytosine-binding domains),激发去乙酰化酶，组蛋白恢复正常，染色体结构改变而抑制基因表达。 有些情况下，组蛋白出现去乙酰化，使得重新甲基化酶与CpG结合，引发染色体结构变化和CpG甲基化，抑制基因表达。;甲基化与基因印记：;CpG甲基化的鉴定;酶切消化法;亚硫酸氢盐法;甲基化特异性PCR;COBRA方法;六、DNA的三级结构;图 解;真核生物染色体的端粒中，有许多富含鸟嘌呤的串联重复序列： 尖毛虫端粒：d（TTTTTGGGGG）n 四膜虫端粒： d（TTGGGG）n 人类端粒： d（TTAGGG）n 这些富含G序列总是位于端粒的3’端、其5’端为富含C的序列，因此端粒在一定条件下可能采取与Poly（G）类似的四联体结构。;在端粒DNA中也发现了许多G-四联体的特征;端粒与PolyG相比又表现出新的特征