微生物基本操作讲义.pptVIP

微生物检测的基本操作知识;主要内容：;§ 1 　清洗、消毒和灭菌;消毒灭菌的方法 ;（一）物理消毒灭菌法;加热灭菌和加热消毒的方法：;干热灭菌法;湿热灭菌法;3. 间歇灭菌法（fractional sterilization）:将待灭菌的物品100℃ 加热15～30分 钟，杀死其中的细菌繁殖体，然后将物品置于37℃温箱中过夜使芽胞发育成繁殖体，次日再通过流通蒸 汽加热，如此连续三次，可将所有细菌繁殖体和芽胞全部杀死。 4.高压蒸汽灭菌法：是灭菌效果最好、目前应用最广的灭菌方法。方法是在一密闭蒸锅—高压蒸汽 灭菌器内进行的。通常 在1.05kg/cm2的压力下，温度达121.3℃,维持15～30分钟，可杀死包括细菌芽胞在内的所有微生物。 此法适用于耐高温和不怕潮湿物品的灭菌。;2.紫外线与射线灭菌法;3.滤过除菌;;（二）化学消毒法;消毒剂类别 ;影响消毒灭菌效果的因素 ;§ 2　显微操作;;普通显微镜的使用方法 ;普通显微镜的保养 ;染色方法;(二)复染色法 　用两种或多种染料染细菌，目的是为了鉴别不同性质的细菌，所以又叫鉴别染色法。主要的复染色法有革兰氏染色法和抗酸性染色法。 　革兰氏染色法：不仅能观察到细菌的形态，而且还可将所有细菌区分为两大类： 　染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示； 　染色反应呈红色的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。 　细菌对革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。;实验材料;实验内容与步骤;3．固定 手持载玻片的一端，标本向上，在酒精灯火焰外层尽快的来回通过2~3次，共约2~3秒钟，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫为宜（不超过60℃）,放置待冷后，进行染色。 4．染色 在涂片薄膜上滴加染色液(石炭酸复红、草酸铵结晶紫或美蓝任选一种)一滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min。 5．水洗 斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。 6．干燥 用吸水纸吸去涂片边缘的水珠，置于室温下自然干燥。用吸水纸时切勿将菌体擦掉。 ;7．镜检 (二)细菌的革兰氏染色步骤 涂片→干燥→固定→初染→水洗→媒染→水洗→脱色→水洗→复染→水洗→干燥→观察 1．取培养物分别做涂片、干燥、固定，方法均与简单染色的相同。 2．用草酸铵结晶紫染色1min后水洗。 3．加碘液媒染1min后水洗。 4．斜置载玻片，滴加95％乙醇脱色，至流出的乙醇不现紫色 为止，大约需时20~30s，随即水洗。 ;5．用蕃红染液复染1min，水洗。 6．用吸水纸吸掉水滴，待标本片干后置显微镜下，用低倍镜观察，发现目的物后用油镜观察，注意细菌细胞的颜色。 ;革兰氏染色图解 ;步骤1：用蒸馏水滴瓶滴一小滴蒸馏水于洁净的载玻片上 ;步骤2：用无菌操作法取少许培养物于蒸馏水滴上 ;步骤3：用接种环将培养物涂布成一薄层 ;步骤4：风干 ;步骤5：在酒精灯火焰外层尽快的来回通过3-4次固定 ;步骤6：结晶紫染色1分钟 ;步骤7：用蒸馏轻轻冲洗玻片 ;步骤8：革兰氏碘液染色1分钟，再用蒸馏水轻轻冲洗 ;步骤9：酒精脱色至下滴液为无色，立即用蒸馏水冲洗 ;步骤10：番红复染1分钟，用蒸馏水轻轻冲洗 ;大肠杆菌（Escherichia coli）革兰氏染色图 ;金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）革兰氏染色 ;注意事项;;;4.培养基制备的基本方法和注意事项 ;4.2培养基的制备记录;4.3培养基成分的称取;4.4培养基各成份的混合和溶化;4.5培养基pH的初步调正;4.6培养基的过滤澄清;4.7培养基的分装;　　分装时最好能使用半自动或电动的定量分装器。分装琼脂斜面培养基时，分装量应以能形成2/3底层和1/3斜面的量为洽当。 　　分装容器应预先清洗干净并经干烤消毒，以利于培养基的彻底灭菌。每批培养基应另外分装20ml培养基于一小玻璃瓶中，随该批培养基同时灭菌，作为测定该批培养基最终pH之用。;4.8培养基的灭菌;4.9培养基斜面和平板的制作 ;平板的制作应在火旁进行，右手拿锥形瓶的底部或试管，左手同时用小指和手掌将棉塞打开，灼烧瓶口，用左手大拇指将培养皿盖打开一缝，至瓶口正好伸入，倾入10～12mL的培养基，迅速盖好皿盖，置于桌上，轻轻旋转平皿，使培养基均匀分布于整个平皿中，冷凝后即成平板。 ;4.10培养基的质量测试 ;4.11培养基的保存;§5接种、分离纯化培养和菌种保存 ;5.1.1接种工具和方法 ;常用的接种方法有以下几种：;(4)浇混接种 (5)涂布接种 (6)液体接种 固体培养基→液体培养基，液体培养物→液体培养基，液体培养物→固体培养基。 (7)注射