分子生物学技术课件1.pptVIP

常用实验基本技术;四大常用基本技术;常用分子生物学技术;RNA制备;步骤;逆转录反应（cDNA合成）;逆转录反应体系的基本成分;逆转录酶;在逆转录酶的作用下，总RNA中的mRNA在体外被反向转录合成DNA拷贝，因拷贝DNA的核苷酸序列完全互补于模板mRNA，称之为互补DNA（cDNA）； 利用DNA聚合酶，以cDNA第一链为模板，以四种脱氧核苷三磷酸（dNTP）为材料，在引物的引导下复制出大量的cDNA或目的片段 ;Oligo dT ：适用于具有PolyA尾巴的RNA。（原核生物的RNA、真核生物的rRNA和tRNA不具有PolyA尾巴。）由于Oligo dT要结合到PolyA 尾巴上，所以对RNA样品的质量要求较高，即使有少量降解也会使全长cDNA合成量大大减少。 随机引物：适用于长的或具有发卡结构的RNA。适用于rRNA、mRNA、tRNA 等所有RNA的反转录反应。主要用于单一模板的RT-PCR反应。 基因特异性引物： 与模板序列互补的引物，适用于目的序列已知的情况。 ;cDNA合成最常用的引物是与真核细胞mRNA分子3端poly(A)结合的12-18核苷酸长的oligo(dT)。　　;避免RNA酶污染;DEPC是RNA酶的化学修饰剂,它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。实验用品用0.1%DEPC水处理，高压蒸汽灭菌后烤干备用或购买经过处理的无RNA酶实验用品。 操作过程中带手套、口罩。 ;PCR;三个基本步骤: (1) 变性(Denature):目的双链DNA片段在94℃下解链; (2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配 (3) 延伸(Extension):在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下,以目的DNA为模板进行合成. 由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍,这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板,所以经25-35轮循环就可使DNA扩增达数百倍。;PCR反应体系的基本成分;模板：PCR反应必须以DNA为模板进行扩增, 模板DNA可以是单链分子,也可以是双链分子,可以是线状分子,也可以是环状分子(线状分子比环状分子的扩增效果稍好). 就模板DNA而言,影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度.;引物： PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。与模板DNA特异互补的单链寡聚核苷酸片段，一般18-30bp, 上下游引物 引物长度约为16-30bp， 太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。 引物中G+C含量通常为40%-60% 四种碱基应随机分布，在3端不存在连续3个G或C,因这样易导致错误引发。;引物3端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应, 以减少由于密码子摆动产生的不配对。 在引物内, 尤其在3端应不存在二级结构 两引物之间尤其在3端不能互补, 以防出现引物二聚体, 减少产量。两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。 引物5端对扩增特异性影响不大, 可在引物设计时加上限制酶位点、核糖 体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等. 通常应在5端限制酶位点外再加1-2个保护碱基 ;引物的选择与设计;Taq DNA聚合酶：Taq DNA聚合酶的酶活性单位定义为74℃下,30min,掺入10nmol/L dNTP到核酸中所需的酶量。致命弱点：出错率 底物（dNTP） ：一般反应中每种dNTP的终浓度为20-200μmol/L。4种dNTP的浓度应该相等,以减少合成中由于某种dNTP的不足出现的错误掺入。 含Mg2+的反应缓冲液：Mg2+浓度对Taq DNA聚合酶影响很大,它可影响酶的活性和真实性,影响引物退火和解链温度, 影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等;;;PCR反应??条件;结果分析;实时定量RT-PCR;RT-PCR;RT-PCR步骤;RT-PCR应用;PCR产物的克隆;常用分子生物学技术;重组质粒的连接;现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。在基因工程中质粒常被用做基因的载体。 具有稳定可靠和操作简便的优点。;质粒载体（vector）是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。 与天然质粒相比,质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素抗性基因)和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列,并去掉了大部分非必需序列,使分子量尽可能减少,以便于基因工程操作。 大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列,这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量