分子生物学的基本竟能和策略幻灯片1.pptVIP

周 俊 宜 ; 生化技术 电泳 层析 离心 分光光度 基因操作 其它; 电泳 层析 离心 分光光度 基因操作 其它 分（离目的基因） 切（割目的基因和载体） 接（连目的基因和载体） 转（化宿主细胞） 筛（选阳性克隆） 表（达目的基因） ;1 理论部分;基因工程原理;基因重组：不同的DNA分子间发生共价连接形成重组DNA 分子。;1972年,P.Berg: 构建第一个DNA重组分子;EcoRI;pSC101;;抗四环素;人体生长激素释放激素(SS);大肠杆菌;大肠杆菌; ;目的基因及载体的分离;1）化学合成法：;2）基因文库;基因组DNA文库;cDNA文库的组建：;引物;PCR技术的基本过程;2 载体DNA的选择;目的基因;理想载体的基本条件：;质粒 噬菌体 腺病毒载体 逆转录病毒载体 ……; 存在于细菌染色体外的小型环状DNA分子。 具有自我复制功能。 带有抗性基因及表型识别等遗传性标记物。 经改造后具有多克隆位点。 举例：pBR322质粒;;;抗Amp;多种酶切口;; ? 噬菌体载体;限制性内切酶酶切;;限制性内切核酸酶 在特异位点上切割DNA分子 分三类，常用为Ⅱ类酶 识别序列呈回文对称 命名：酶来源的生物名称缩写 属名-种名-株名-发现次序 ; ;5’NNNNNNNGAATTCNNNNNNNN3’ 3’NNNNNNNCTTAAGNNNNNNNN5’; 5’NNNNNNGTTAACNNNNN3‘ 3’NNNNNNCAATTGNNNNN5‘;磷酸二酯键的形成; T4-DNA连接酶： T4-噬菌体 连接温度：不高于粘性末端熔点温度（Tm） ≤15℃： 15℃/6h； 12℃/8h； 8℃/12h； ;连接方式： 相同粘性末端的连接 平头末端的连接 不同粘性末端的连接 人工粘性末端的连接 ;粘端连接;平端连接;重组体的转化;JM109感受态;原核细胞的转化（细菌转化）;2）转化方法;CaCl2处理;基因重组;3）转化率：转化细胞/细胞总数 影响因素： 载体：载体性质、空间结构、分子大小等 受体细胞 转化过程;含氨苄平板;转化后的克隆群体：;1遗传检测法;2）标志补救（?-半乳糖苷酶法）;X-gal;（LacZ基因 N端序列）;2 电泳检测法;原位杂交;4 免疫化学检测法;5 DNA序列检测;外源基因在??主细胞中的表达;1 E.coli表达体系 优势： 一种成熟的基因克隆表达的受体细胞 繁殖迅速，培养代谢易于控制 易于进行遗传操作和高效表达;;2目的基因在E.coli中的高效表达;3目的基因表达产物的检测;2）表达蛋白生物学功能检测;4目的蛋白的分离纯化;基因载体;Amp;阻遏蛋白基因;ori;目的基因;shying@gzsums.edu.cn